构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的方法，包括如下步骤：（1）制备同源重组载体：（2）ES细胞打靶及筛选；（3）重组干细胞PCR鉴定；（4）嵌合小鼠制备：PCR鉴定获得同源重组克隆后，将正确同源重组的ES细胞通过囊胚腔注射获得嵌合体子代；（5）F1代杂合小鼠Kv1.3+/-繁育。此外，本发明专利技术还公开了用于构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的PCR引物对。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物和医学实验模型的制备技术和细胞构建领域。涉及一种构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的方法。
技术介绍
与其它器官相比，缺血/再灌注（I/R）对心脏产生的损伤更迅速更严重。心肌细胞更易出现自由基增多和供能障碍。线粒体早期即出现明显损伤，显微镜下见心肌、冠脉平滑肌和内皮细胞病变，尤其是线粒体病变。表现为无复流（器官水平的血管痉挛）和心脏失功。纵观已知研究结果，线粒体供能障碍、钙钾异常导致凋亡启动和正反馈甚至结构破坏是主要环节。目前钾通道与心脏保护关系开始成为研究热点。国内外研究发现KATP钾通道在缺血预处理中发挥作用，与心肌保护的关系是肯定的。在我们前期的研究中也发现，阿片受体激动剂预处理可以产生明显的心肌保护作用，并且这些作用和线粒体KATP通道有关(刘中民，2008)，为进一步探讨钾通道药物用于心肌保护提供了实验依据。随着研究的展开，我们发现，心肌损伤和线粒体Kv1.3钾通道关系密切，值得深入研究，其中要着重探索以下主要方面的问题。哺乳动物细胞线粒体内已知存在两种涉及调节钾内流的钾通道，KATP和Bkca。淋巴细胞内线粒体内已经发现存在Kv1.3钾通道。心肌内线粒体是否存在Kv1.3钾通道对研究心肌保护至关重要。本专利技术涉及该领域。心肌损伤时线粒体Kv1.3钾通道的重要性和机制需着重研究：首先,与已知有保护作用的两个线粒体钾通道（KATP、Bkca）比较，线粒体Kv1.3在心肌损伤中的地位如何?其次，如果关系很重要，这种影响对心肌细胞的影响是否超过对内皮和冠脉平滑肌的影响？最后，涉及机制方面的研究，该通道的下游信号通道如何，和邻近分子的相互作用有那些可以进一步了解？线粒体Kv1.3与心肌损伤关系问题、只有这些问题有所了解，才能明确线粒体Kv1.3与心肌损伤的关系。Kv1.3通道是否在心肌中有表达，它们和MI/RI是否有关？抑或和其它通道协同作用尚不清楚，对这些通道的进一步研究将为MI/RI的防治以及药物的开发奠定基础。为此，我们构建了Kv1.3基因敲除小鼠。在实验中我们发现，野生型小鼠心房组织表达Kir3.4明显高于其他组织，而Kv1.3不仅在心房组织有表达，在心室心肌中表达更明显。心脏三种实质细胞均见免疫标记的呈现。Kv1.3基因敲除后，小鼠表现能量代谢显著变化和抗肥胖、体型突变等表现。并且引起外周细胞对胰岛素增敏效应（表现为脂肪、骨胳肌细胞膜的葡萄糖转运蛋白增加，糖摄取增加）。该通道在依赖胰岛素的组织普遍表达。心肌是依赖胰岛素的组织，该通道心肌细胞内的详细定位和作用缺乏研究。对自发高血压鼠血管的基因表达研究提示，Kv1.3与血管张力过高密切有关。血管平滑肌Kv1.3通道是否在心脏I/R中产生痉挛致使无复流值得研究。最近还发现，脑组织内皮细胞也表达Kv1、2钾通道，Kv1.3参与内皮细胞膜电位平衡作用，其阻断剂对I/R防止有重要意义。Kv1.3基因在各种组织的表达提示存在广泛型和差异性。在心脏组织中，成肌细胞以及成纤维细胞均表达Kv1.3通道，并且与成肌细胞间以及成纤维细胞和心肌细胞之间的偶联有关，同时涉及到钙依赖基因的编程。而此前的文献报道，一些组织的纤维细胞表面不表达该基因。这些差异有什么生理意义不知道。由此,启发考查心脏三种实质细胞（心肌、血管平滑肌、内皮）内、线粒体内的Kv1.3的变化与心肌保护存在的一定关系。目前尚缺乏这方面的研究。因此有必要进一步研究心脏不同细胞该基因的生理病理情况下的表达规律。线粒体KV1.3通道在心肌不同细胞的表达及作用可用通道药物组合干预：目前发现线粒体存在的钾通道KATP和BKca都有保护心肌损伤的作用。“线粒体渗透转换孔”被活性氧（ROS）激活而大量通透启动凋亡甚至肿胀破裂。KATP的通道开放有利于减轻该过程，保护心肌。此外，文献报道线粒体内膜上钙依赖钾通道Bkca也和损伤的保护有关系。“线粒体渗透转换孔”的阻断（环孢素等）也可能对心肌保护有作用。“线粒体渗透转换孔”直接涉及线粒体的膜完整性维持，直接与细胞的坏死和凋亡有关。研究淋巴细胞的发育历程发现，线粒体内除了存在KATP和Bkca，还有Kv1.3三种钾通道。它们和线粒体的钾浓度、线粒体容积、内膜电位、凋亡有关。T淋巴细胞发育和转变记忆细胞时候，人们观察到Kv1.3钾通道分布于淋巴细胞膜,能够调节淋巴细胞激活、增殖、分化和细胞因子分泌,是免疫调节的靶点。在T淋巴细胞线粒体内膜上的Kv1.3分子通道对细胞的抗凋亡有重要作用。K通道的失敏也与缺氧反应和电传导功能有密切关系。我们前期预实验也发现心肌内存在Kv1.3通道蛋白。该蛋白是否直接和心肌损伤机理存在联系尚未知。由于线粒体内有KATP和Kv1.3、Bkca三种钾通道，共同的作用都是释放钾到线粒体内。三者的肽片段感受器不同，三者的作用不同，下游信号通路不一样。而三者在心肌线粒体内的神秘关系有待揭示。故提出整体研究方案，在基因敲除鼠等模型和活体、器官、细胞、信号通路等不同层面上用三种钾通道各自特异阻断剂和开放剂经不同组合干预，统计分析分离因素，从而了解不同的钾通道在抗损伤的作用。深入研究线粒体Kv1.3通道参与细胞凋亡、能量代谢的信号通路：目前，钾通道和心肌保护关系研究已经发展到能够了解通道下游分子信号联系及其损伤预防设计的层面。线粒体内三种钾通道下游分子联系开始引起关注。这从其它细胞的研究发现可以启发心肌细胞该通道下游信号通路研究的思路，对下一步研究该通道在心肌保护时的作用尤其对线粒体钾通道研究提供了有效的研究思路和手段。（1）在研究淋巴细胞的该分子部分通路已了解。（2）神经元的该分子部分通路已了解。（3）本研究组前期已经开展了心脏表达文库（美国进口文库）-酵母双杂交筛选（钾通道下游)预实验，实验完成可以指导下一步探索研究心肌细胞Kv1.3通道下游信号通路明确方向。这些理论和实验都为研究信号通路提供了可行性。目前，单通道基因敲除模型小鼠的制备为这类研究提供了很好的平台。综上所述，专利技术背景有以下几点：①在临床实践中，MI/RI仍然是威胁高龄、危重心脏病人治疗效果的高危因素，需进一步探讨MI/RI的防治方法；②心肌缺血/再灌注损伤时心肌保护和线粒体损伤程度及钾离子通道有关，例如KATP、Bkca。T细胞Kv1.3钾通道与线粒体的钾浓度、线粒体容积、内膜电位、能量代谢以及凋亡有关。③前期研究发现脑组织线粒体Kv1.3通道参与缺血再灌注损伤。我们研究发现，Kv1.3不仅在心房组织有表达，在心室心肌中表达更明显。④推测心脏三种实质细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备同源重组载体：（2）ES细胞打靶及筛选；（3）重组干细胞PCR鉴定；（4）嵌合小鼠制备：PCR鉴定获得同源重组克隆后，将正确同源重组的ES细胞通过囊胚腔注射获得嵌合体子代；（5）F1代杂合小鼠Kv1.3+/‑繁育。

【技术特征摘要】
1.一种构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，
包括如下步骤：（1）制备同源重组载体：（2）ES细胞打靶及筛选；（3）重组干细胞PCR
鉴定；（4）嵌合小鼠制备：PCR鉴定获得同源重组克隆后，将正确同源重组的ES细胞通
过囊胚腔注射获得嵌合体子代；（5）F1代杂合小鼠Kv1.3+/-繁育。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）具体为：打靶载体使用BAC载体，构
建好的质粒用BanmHI、EcoRI、HindIII酶切，产物电泳照相后鉴定条带。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）为：将打靶载体电击转化胚胎干细胞，
使其与基因组发生同源重组。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，设计如下PCR引物对：P1：
ATGAAACCATTCACATAGCCT AAACAG，如SEQ ID NO.1所示；P2：
CCTCCCCCGTGCCTTCCTTG AC，如SEQ ID NO.2所示；P3：
GGCAAAGCTAATGGTTACTGGCAAATGT，如SEQ ID NO.3所示；P4：
CTGAGCCCAGAAAGC GAAGGA，如SEQ ID NO.4所示；P1和P2为一对引物，P3和
P4为一对引物。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述PCR反应条件为：94℃
30s；67℃30s；72℃5min；35个...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘中民，范慧敏，张良平，
申请(专利权)人：上海市东方医院，
类型：发明
国别省市：上海;31