一种利用TALEN技术构建可敲除小鼠CRAMP基因质粒的方法技术

本发明专利技术公开了一对用于定向敲除鼠源性细胞CRAMP基因的TALEN识别序列对及利用该识别序列构建的载体质粒。所述TALEN识别序列对的基因序列分别如序列表SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12所示。所述的载体质粒包括TALEN L链和R链；所述的TALEN L链是由SEQ ID NO.1所示序列的碱基编码；所述的TALEN R链是由SEQ ID NO.2所示序列的碱基编码。本发明专利技术还公开了一种内源性CRAMP基因敲除的细胞的制备方法，将编码TALEN L链和R链的核苷酸序列分别插入原核表达载体中，转染入含有内源性的CRAMP基因的细胞，从而得到内源性CRAMP基因被敲除的细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地说，是一种利用TALEN技术构建可敲除小鼠CRAMP基因质粒的方法。
技术介绍
如何对基因组的进行精确高效的靶向修饰一直以来是一个难题。传统的基因打靶技术的理论基础是细胞内自然发生的同源染色体随机互换，使用这种技术进行基因打靶，效率非常低，通常只有10-6-10-8。近年发展很快的序列特异的核酸酶可以用于精确的基因组靶向修饰，它们一般为融合蛋白，组成是一个特异序列的DNA识别结构域以及一个非特异的核酸内切酶结构域。修饰机制是受限由DNA识别域将核酸内切酶定位到需要编辑的基因组区域，非特异性核酸内切酶就会切断双链DNA，这样形成的DNA双链断裂就会激活DNA自我修复，而DNA自我修复的过程中则会出现基因突变，从而实现特定基因的敲除，或是引入新的同源序列与其进行同源重组，实现特定基因的敲入。如今研究最清晰、应用最广泛的序列特异核酸酶是锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFNs)。尽管锌指核酸酶技术的出现促使基因靶向修饰技术向前迈进了一大步，但是ZFN技术还存在很多缺陷，例如对位点识别的不确定性，打靶效率低下，并且脱靶率较高。并且目前对于许多研究者而言，设计出特异性靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是一个相当大的技术挑战。近期有研究发现黄单胞杆菌属的植物病原菌中存在的一种转录激活因子样效应物(transcription activator-like effector，TALE)通过结合宿主的DNA和启动特定的效应物基因来使植物致病或者引发防御。这种识别是基于一系列(34个)有简并性的氨基酸序列来实现的。与ZFN相似的是，TALEs也是由12个或以上特异识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。这一系列模块的氨基酸大多数序列都是重复的，而不同的地方基本上是在重复序列的12和13位，这些重复的氨基酸序列叫做重复可变序列(RVDs)。第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作di-residues。然而不同于每个锌指蛋白识别特异性的三联体碱基，TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱基，并且没有明显的前后核酸依赖性。TALEs可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。在TALEs上附加一个核酸酶就生成了转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)。TALENs可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而敲除或导入新的遗传物质。中国专利文献CN 201410528743.6，公开了一对靶向斑马鱼Forkhead box n1基因的Talen识别序列及其用于靶向敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的mRNA的制备方法。中国专利文献CN201310455151.1公开了一种靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法，其通过构建TALEN质粒、小鼠同源重组模板质粒和大鼠同源重组模板质粒，并将该相应的质粒分别转入小鼠或大鼠细胞中，能获得稳定细胞株表达各种外源基因。中国专利文献CN201310124191.8，公开了一种穿透型TAT-TALEN蛋白及内源性基因被敲除的细胞的制备方法和应用。关于靶向敲除小鼠CRAMP基因的TALEN识别序列、质粒及利用TALEN技术靶向敲除小鼠CRAMP基因的方法，目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于定向敲除鼠源性细胞CRAMP基因的TALEN识别序列对。本专利技术的再一的目的是，提供一种利用上述识别序列对构建的小鼠CRAMP基因敲除的载体质粒。本专利技术的另一的目的是，提供上述载体质粒的用途。本专利技术的第四个目的是，提供一种内源性CRAMP基因敲除的细胞的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于定向敲除鼠源性细胞CRAMP基因的TALEN识别序列对，所述TALEN识别序列对由左臂识别序列和右臂识别序列组成；所述左臂识别序列如SEQ ID NO.9所示；所述右臂识别序列如SEQ ID NO.12所示。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：利用上述识别序列构建的小鼠CRAMP基因敲除的载体质粒，包括TALEN L链和TALEN R链。所述的TALEN L链是由SEQ ID NO.1所示序列的碱基编码；所述的TALEN R链是由SEQ ID NO.2所示序列的碱基编码。将该载体质粒在体外转录生成mRNA后注射到小鼠的受精卵中就能够得到CRAMP敲除的嵌合体小鼠，转染到鼠源性细胞中就能够得到相应的CRAMP基因敲除的细胞株。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：所述的载体质粒在定向敲除鼠源性细胞的CRAMP基因，构建CRAMP基因敲除的小鼠中的应用。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种内源性CRAMP基因敲除的细胞的制备方法，将所述的编码TALEN L链和编码TALEN R链的核苷酸序列分别插入原核表达载体中，转染入含有内源性的CRAMP基因的细胞中以敲除CRAMP基因，从而获得内源性CRAMP基因被敲除的细胞。利用本专利技术的载体质粒构建获得了CRAMP基因敲除的细胞株3T3Δ-cramp和LLC1Δ-cramp。本专利技术优点在于：采用先进的TALEN基因敲除技术，设计一对特异TALENs识别序列，该识别序列针对CRAMP基因，可构建载体质粒转染到鼠源性细胞中，通过药物筛选，有限稀释挑选单克隆而快速的获得所需的纯细胞株。本专利技术的质粒在体外转录生成mRNA后注射到小鼠的受精卵中就能够快速得到CRAMP基因敲除的F0代嵌合体小鼠。本专利技术具有构建CRAMP载体质粒周期短、转染效率高、定向敲除准确等优点；应用本专利技术在对CRAMP基因进行敲除的同时不会引入任何外源性基因，不存在随机插入到细胞的基因组中引入插入性突变的风险，并且在进入细胞发挥作用后逐渐被细胞降解不会一直存在于细胞内。附图说明附图1是TALEN质粒构建及活性鉴定流程。附图2是TALEN的左、右臂识别序列。附图3是CRAMP-L2氨基酸标准序列比对结果一。附图4是CRAMP-L2氨基酸标准序列比对结果二。附图5是CRAMP-R2氨基酸标准序列比对结果一。附图6是CRAMP-R2氨基酸标准序列比对结果二。附图7是细胞基因组测序套峰。附图8是基因敲除/突变位点分析。附图9是Western Blot检测LLC1和LLC1Δ-cramp细胞中的cramp蛋白表本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于定向敲除鼠源性细胞CRAMP基因的TALEN识别序列对，其特征在于，所述TALEN识别序列对由左臂识别序列和右臂识别序列组成；所述左臂识别序列如SEQ ID NO.9所示；所述右臂识别序列如SEQ ID NO.12所示。

【技术特征摘要】
1.用于定向敲除鼠源性细胞CRAMP基因的TALEN识别序列对，其特征在
于，所述TALEN识别序列对由左臂识别序列和右臂识别序列组成；所述左臂识
别序列如SEQ ID NO.9所示；所述右臂识别序列如SEQ ID NO.12所示。
2.利用权利要求1所述的识别序列构建的小鼠CRAMP基因敲除的载体质
粒，其特征在于，所述的载体质粒包括TALEN L链和TALEN R链。
3.根据权利要求2所述的小鼠CRAMP基因敲除的载体质粒，其特征在于，
所述的TALEN L链是由SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李冬，吴军录，权文强，
申请(专利权)人：上海市同济医院，
类型：发明
国别省市：上海;31