杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，涉及杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株及其应用。所述突变株NB2011ΔExoU，保藏号为CGMCC No.12430，其制备方法为：利用同源重组基因敲除技术将杀香鱼假单胞菌野生株NB2011的ExoU基因进行基因敲除，经PCR技术筛选鉴定确定所获得的菌株为基因敲除突变株。用本发明专利技术所述的突变株进行动物实验研究其致病性，其结果是对实验动物的毒力显著降低，可应用于杀香鱼假单胞菌弱毒性疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，涉及杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株及其应用。
技术介绍
大黄鱼是我国东部沿海网箱养殖的重要经济鱼类品种，近年来受到内脏白点病的危害，造成很高的死亡率和严重的经济损失。杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是该病病原菌。致病株NB2011基因组测序和注释结果表明，该菌编码典型的三型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)，该系统存在于很多革兰氏阴性致病菌中，形态表现为跨越细菌外膜直接插入真核宿主细胞膜的一针形复合体，菌体通过此复合体将多种效应蛋白输送到宿主细胞中，发挥破坏宿主细胞骨架结构、改变信号传递和免疫反应类型，控制宿主细胞的应答等功能，从而建立感染、实现传播。NB2011的T3SS与人类条件性病原菌铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的相应系统最为接近。在铜绿假单胞菌中，exoU作为该菌T3SS分泌的4种效应蛋白之一，通过T3SS直接输送到宿主细胞中，与真核细胞膜结合，发挥磷脂酶A活性，裂解细胞，造成细胞和组织坏死，是重要的毒力因子；该基因的存在是铜绿假单胞菌强毒株的重要标志，基因缺失的突变株毒力显著减弱。本实验室已经验证了杀香鱼假单胞菌NB2011通过T3SS分泌一效应蛋白，其氨基酸序列与铜绿假单胞菌细胞毒素exoU存在45％的同源性，同样具有磷脂酶A活性，可能是该菌的重要毒力因子。大黄鱼内脏白点病流行和爆发于水温较低的冬春季节，鱼类不摄食，基本无法通过投喂药物的方式控制病情，目前尚无有效的防治方法。利用疫苗接种的方法预防鱼类感染性疾病的发生，已经有半个多世纪的历史，目前世界范围内成功使用的鱼类疫苗包括冷水性弧菌疫苗、鲑科鱼类红嘴病和肠炎病二联疫苗、鱼类传染性胰腺坏死病疫苗等，国内有草鱼病毒性出血病疫苗、淡水鱼类细菌性败血症疫苗、副溶血弧菌和溶藻弧菌二联疫苗等，获得了较好的防病效果。开发特异性良好的高效疫苗，也是预防大黄鱼内脏白点病的重要方法。针对杀香鱼假单胞菌致病株NB2011，前期研究结果表明，常规灭活疫苗和主要表面抗原免疫能够刺激显著水平的抗体应答，但不能提供有效保护；超微病理观察到了该菌在巨噬细胞内存活和增殖现象，提示了该菌可能是一种兼性胞内病原菌。迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种典型的胞内寄生菌，可感染多种水产养殖动物，采用基因敲 除技术联合缺失多种T3SS效应蛋白基因的突变株毒力大为减弱，作为弱毒苗能够提供有效保护。针对杀香鱼假单胞菌，我们也需要探索研制活的弱毒疫苗、DNA疫苗等新型疫苗，模仿自然感染途径，有效激活细胞免疫，才能对宿主提供足够保护。本专利技术首次构建了杀香鱼假单胞菌NB2011三型毒力因子ExoU基因敲除突变株，显著降低了对大黄鱼的毒力，接种鱼体后可有效激发细胞免疫和体液免疫，预防侵袭和疾病的发生；避免了常规灭活疫苗或亚单位疫苗激发产生的体液抗体不能到达宿主细胞内，无法有效清除胞内病原的不足。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一株杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株。本专利技术所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供该突变株的应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：该杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株NB2011ΔExoU，其特征在于，NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基因被卡那霉素抗性基因盒KanR所代替，该突变菌株的菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.12430，保藏日期为2016年5月12日；所述的NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述的卡那霉素抗性基因盒KanR序列如SEQ ID NO.2所示。本专利技术还提供一种杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株的构建方法，其特征在于包含以下步骤：(1)根据如SEQ ID NO.3所示的杀香鱼假单胞菌野生株NB2011基因组ExoU编码基因的上游DNA序列，设计PCR特异引物ExoU-5F和ExoU-5R；根据如SEQ ID NO.4所示的杀香鱼假单胞菌野生株NB2011基因组ExoU编码基因的下游DNA序列，设计PCR特异引物ExoU-3F和ExoU-3R；以pKD4质粒为模板，设计一对特异引物Kan-F和Kan-R；其中引物ExoU-5F序列如SEQ ID NO.5所示，引物ExoU-5R序列如SEQ ID NO.6所示，引物ExoU-3F序列如SEQ ID NO.7所示，引物ExoU-3R序列如SEQ ID NO.8所示，引物Kan-F序列如SEQ ID NO.9所示，引物Kan-R序列如SEQ ID NO.10所示；(2)以NB2011基因组DNA为模板，分别以ExoU-5F/ExoU-5R和ExoU-3F/ExoU-3R为引物，扩增得到5’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU上游DNA序列片段FA和3’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU下游DNA序列片段RA；以pKD4质粒为模板，以Kan-F/Kan-R为特异引物扩增得到两端含ExoU上下游同源序列的卡那霉素抗性基因盒 KanR；以ExoU-5F/ExoU-3R为引物，以纯化的上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因序列为模板，进行融合PCR，获得打靶片段即上游片段-卡那霉素抗性基因盒-下游片段FA-KanR-RA；(3)打靶载体pCVD:exoU的构建：将所述的FA-KanR-RA插入pCVD442载体的Sma I酶切位点间得打靶载体pCVD:exoU；(4)打靶载体pCVD:exoU电转化转入大肠杆菌E.coli β2155，获得供体菌β2155/pCVD442:exoU；(5)β2155/pCVD442:exoU供体菌与受体菌杀香鱼假单胞菌NB2011进行接合实验，在卡那霉素平板上筛选获得卡那霉素抗性的杀香鱼假单胞菌克隆，其基因组已整合打靶序列，称为NB2011/pCVD442:ΔExoU。(6)在含10％蔗糖的LB平板上划线接种NB2011/pCVD442:ΔExoU，培养至单克隆形成，通过PCR技术筛选鉴定获得ExoU基因被Kan抗性基因取代的克隆，命名为NB2011ΔexoU:Kan，即得到保藏号为CGMCC No.12430的杀香鱼假单胞菌型exoU基因敲除突变株，简称NB2011ΔexoU。进一步的上述杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株的构建方法，其特征在于所述的基因敲除载体pCVD::exoU的构建包含如下步骤：(a)卡那霉素抗性基因盒KanR的克隆：以Kan-F/Kan-R为特异引物，以提取的pKD4质粒DNA为模板扩增得到两端分别含ExoU上下游同源序列的卡那霉素抗性基因盒KanR；(b)ExoU上、下游同源片段的扩增：分别以ExoU-5F/ExoU-5R和ExoU-3F/ExoU-3R为引物，扩增得到5’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU上游DNA序列片段FA和3’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU下游DNA序列片段RA；(c)基因打靶片段的融合：ExoU基因上、下游同源重组臂和卡那霉素抗性基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株NB2011ΔExoU，其特征在于，NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基因被卡那霉素抗性基因盒Kan所代替，该突变菌株的菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.12430，保藏日期为2016年5月12日；所述的NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述的卡那霉素抗性基因盒Kan序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株NB2011ΔExoU，其特征在于，NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基因被卡那霉素抗性基因盒Kan所代替，该突变菌株的菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.12430，保藏日期为2016年5月12日；所述的NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述的卡那霉素抗性基因盒Kan序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种根据权利要求1所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株的构建方法，其特征在于包含以下步骤：(1)根据如SEQ ID NO.3所示的杀香鱼假单胞菌野生株NB2011基因组ExoU编码基因的上游DNA序列，设计PCR特异引物ExoU-5F和ExoU-5R；根据如SEQ ID NO.4所示的杀香鱼假单胞菌野生株NB2011基因组ExoU编码基因的下游DNA序列，设计PCR特异引物ExoU-3F和ExoU-3R；以pKD4质粒为模板，设计一对特异引物Kan-F和Kan-R；其中引物ExoU-5F序列如SEQ ID NO.5所示，引物ExoU-5R序列如SEQ ID NO.6所示，引物ExoU-3F序列如SEQ ID NO.7所示，引物ExoU-3R序列如SEQ ID NO.8所示，引物Kan-F序列如SEQ ID NO.9所示，引物Kan-R序列如SEQ ID NO.10所示；(2)NB2011基因组DNA为模板，分别以ExoU-5F/ExoU-5R和ExoU-3F/ExoU-3R为引物，扩增得到5’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU上游DNA序列片段FA和3’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU下游DNA序列片段RA；以pKD4质粒为模板，以Kan-F/Kan-R为特异引物扩增得到两端含exoU上下游同源序列的卡那霉素抗性基因盒KanR；以ExoU-5F/ExoU-3R为引物，以纯化的上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因序列为模板，进行融合PCR，获得打靶片段即上游片段-卡那霉素抗性基因盒-下游片段FA-KanR-RA；(3)打靶载体pCVD:exoU的构建：将所述的FA-KanR-RA插入pCVD442载体的Sma I酶切位点间得打靶载体pCVD:exoU；(4)打靶载体pCVD:exoU电转化转入大肠杆菌E.coliβ2155，获得供体菌β2155/pCVD442:exoU；(5)β2155/pCVD442:exoU供体菌与杀香鱼假单胞菌受体菌进行接合实验，在卡那霉素平板上筛选获得卡那霉素抗性的杀香鱼假单胞菌克隆，其基因组已整合打靶序列，称为NB2011/pCVD442:ΔExoU。(6)在含10％蔗糖的LB平板上划线接种NB2011/pCVD442:ΔExoU，培养至单克隆形成，通过PCR技术筛选鉴定获得ExoU基因被Kan抗性基因取代的克隆，命名为NB2011ΔexoU:Kan，即得到保藏号为CGMCC No.的杀香鱼假单胞菌型ExoU基因敲除突变株，简称NB2011ΔexoU。3.根据权利要求2所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株的构建方法，其特征在于所述的基因敲除载体pCVD::exoU的构建包含如下步骤：(a)卡那霉素抗性基因盒KanR的克隆：以Kan-F/Kan-R为特异引物，以提取的pKD4质粒DNA为模板扩增得到两端分别含ExoU上下游同源序列的卡那霉素抗性基因盒KanR；(b)ExoU上、下游同源片段的扩增：分别以ExoU-5F/ExoU-5R和ExoU-3F/ExoU...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛芝娟，王越峰，高丽婷，陈吉刚，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33