具有增加的碳通量效率的方法和生物技术

本发明专利技术涉及一种非天然存在的微生物，其包括琥珀酰基‑CoA合成酶或转移酶的第一衰减以及琥珀酰基‑CoA转化酶或编码在具有琥珀酰基‑CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径之内的产琥珀酸酶的基因的至少第二衰减。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景本专利技术提供了非天然存在的微生物，其具有通过氧化的TCA循环从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的减少的碳通量。本专利技术还提供使用该微生物减少通过氧化的TCA循环从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量的方法。通过过量CO2生产的碳损失可以来自中心代谢的三个主要路线：戊糖磷酸途径、乙醛酸支路和氧化三羧酸(TCA)循环。该戊糖磷酸途径的主要的CO2生成反应是磷酸葡萄糖脱氢酶。在该TCA循环和乙醛酸支路中可促成碳损失的酶包含，例如丙酮酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸氧化酶、α-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和苹果酸酶。碳损失也可以来自其他的代谢反应，其包含，例如甘氨酸裂解系统、甲酸氢裂解酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、丙酮酸氧化酶、乙酰乳酸合酶和2-氧代-4-甲基-3-羧基戊酸脱羧酶、天冬氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱羧酶和参与脂肪酸生物合成的酶。因此，需要用于降低碳损失并提高碳通量效率的替代手段。本专利技术满足了这种需要，还具有相关的优点。专利技术概述本专利技术涉及一种非天然存在的微生物，其包括琥珀酰基-CoA合成酶或转移酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或编码在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径之内的产琥珀酸酶的基因的至少第二衰减。该琥珀酰基-CoA合成酶可以由sucCD编码。该琥珀酰基-CoA转化酶可以是YciA CoA水解酶这种酶。该微生物可以进一步包含吡啶核苷酸转氢酶的增加的表达，包含其中该吡啶核苷酸转氢酶由pntAB编码。该微生物还可以包含非琥珀酰基-CoA合成酶或转移酶的TCA循环酶的衰减。该微生物可以包含用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径。该生物衍生化合物可以是4-羟基丁酸酯(4HB)、1，4-丁二醇(1，4-BDO)、1，3-丁二醇(1，3-BDO)、聚羟基丁酸酯(PHB)、丁二烯、己二酸酯、6-氨基己酸酯、己内酰胺或甲基丙烯酸或本文披露的其他化合物。本专利技术涉及用于提高生物衍生化合物的产量的其他遗传改变。附图说明图1示出了生成CO2的中心代谢途径，包含(1)该戊糖磷酸途径；(2)完全氧化的TCA循环；以及(3)该乙醛酸支路。缩写：Glc是葡萄糖，G6P是葡萄糖-6-磷酸，F6P是果糖-6-磷酸，FBP是果糖-1，6-双磷酸，G3P是甘油醛-3-磷酸，PEP是磷酸烯醇丙酮酸，Pyr是丙酮酸，cit是柠檬酸，Icit是异柠檬酸，AKG是α-酮戊二酸，Succ是琥珀酸，Fum是富马酸，Mal是苹果酸，OAA是草酰乙酸，6PGL是6-磷酸葡糖酸内酯，Ru5P是核酮糖-5-磷酸，E4P是赤藓糖-4-磷酸，S7P是景天庚酮糖-7-磷酸，以及Glx是乙醛酸。专利技术详述本专利技术提供非天然存在的微生物，其具有通过氧化的TCA循环从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的减少的碳通量，其中该微生物包含一种或多种遗传破损。本专利技术还提供使用该微生物减少通过氧化的TCA循环从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的碳通量的方法。如本文所用，术语“非天然存在的”当关于本文提供的微生物使用时，意指该微生物具有至少一种通常不会在相关物种的天然存在的菌株(包括相关物种的野生型菌株)中发现的遗传改变。遗传改变包括，例如，引入编码代谢多肽的可表达的核酸的修饰、其他核酸新增、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其他功能中断。这些修饰包括，例如，相关物种的异源多肽、同源多肽或异源和同源多肽的编码区和功能片段。其他修饰包括，例如，其中该修饰改变基因或操纵子的表达的非编码调控区域。示例性代谢多肽包含，例如将琥珀酰基-CoA转化为琥珀酸的酶或蛋白质、三羧酸(TCA)循环酶、吡啶核苷酸转氢酶、NADH脱氢酶、泛醇氧化酶、甲基萘醌生物合成酶、甲基萘醇生物合成酶(menaquinol biosynthetic enzyme)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)以及生物衍生的产物生物合成途径内的酶或蛋白质。代谢修饰是指从其天然存在的状态发生改变的生化反应。因此，非天然存在的微生物可以具有对编码代谢多肽的核酸或其功能片段的遗传修饰。本文披露了示例性代谢修饰。本专利技术的该非天然存在的微生物可以包含稳定的遗传改变，这指可以培养超过五代而无改变损失的微生物。一般地，稳定的遗传改变包括持续超过10代的修饰，具体地，稳定的修饰将持续超过约25代，以及更具体地，稳定的遗传修饰将超过50代，包括永久地。如本文所用，当关于微生物使用时，术语“分离”意指当相关微生物在自然界中被发现时，基本上不含至少一种组分的生物。该术语包括当在其自然环境中被发现时从部分或全部组分中脱离的微生物。该术语还包括当其在非天然存在的环境中被发现时从部分或全部组分中脱离的微生物。因此，当分离的微生物在自然界中被发现或者当其在非天然存在的环境中培育、储存或生存时，它部分或全部地从其他物质中分离。分离的微生物的具体例子包括部分纯的微生物、基本上纯的微生物和在非天然存在的培养基中培养的微生物。如本文所用，术语“微生物”意在指任何作为包含在古菌域、细菌域或真核域的显微细胞存在的生物。因此，该术语意包括原核或真核细胞或具有显微尺寸的生物并包括所有种类的细菌、古菌和真细菌以及真核微生物(如酵母和真菌)。该术语还包括任何种类的可被培养用于生产生物化学品的细胞培养物。关于具有参考的基因破坏或其他遗传改变的微生物使用时，亲本微生物或亲本的微生物被理解为是指这样的微生物或菌株，如果将该参考的基因破坏或其他遗传改变排除在比较之外，则其具有的基因型与具有该参考的基因破坏或其他遗传改变的微生物基本相似。因此，亲本微生物是指菌株的基本上相似的基因型，其中该参考的基因破坏或其他遗传改变被引入以生成修饰的生物。可以理解的是，亲本微生物可以例如，根据是否考虑单个或多个遗传改变，通过一种以上的遗传改变(基因添加和/或破坏)而不同。本领域的技术人员将很容易理解这样的亲本微生物的含义，因为该微生物被认为是用于观察一个或多个遗传改变的影响的，如本领域中所理解的，适当的对照物。如本文所用，术语“CoA”或者“辅酶A”意在指有机辅因子或者辅基(酶的非蛋白质部分)，它的存在为许多酶(脱辅基酶)的活性所需以形成活性酶系统。辅酶A在某些缩合酶中起作用，在乙酰基或者其他酰基基团转移以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及在其他乙酰基化中起作用。如本文所用，当关于培养或培育条件使用时，术语“基本上厌氧”意指氧量少于液体培养基内溶解的氧的饱和量的约10％。该术语还意在包括在小于约1％的氧的气氛中保持的液体或固体培养基的密封室。如本文所用，“外源”意指有关分子或有关活性被引入宿主微生物。分子可以例如，通过将编码核酸引入宿主遗传物质，如通过整合入宿主染色体或作为非染色体遗传物质(如质粒)被引入。因此，当关于编码核酸的表达使用时，该术语指将编码核酸以可表达的形式引入微生物。当关于生物合成活性使用时，该术语指被引入宿主有关生物的活性。来源可以是例如，表达引入宿主微生物后有关活性的同源或异源编码核酸。因此，术语“内源”指在宿主内存在的有关分子或活性。同样，当关于编码核酸的表达使用时，该术语指包含在微生物体内编码核酸的表达。术语“异源”指来自与有关物种不同的来源的分子或活性而“同本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非天然存在的微生物，其包含选自由如下组成的组的遗传改变：(1)cydA或cydB的衰减，以及选自由如下组成的组的一种或多种遗传改变：(a)使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(b)由pykF编码的蛋白质的衰减；(c)由sucCD编码的蛋白质的衰减；(d)由yciA编码的蛋白质的衰减；(e)使由ackA编码的蛋白质以及由pta编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(f)使由cyoB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(g)由pykA编码的蛋白质的衰减；(h)由arcA编码的蛋白质的衰减；(i)由crr编码的蛋白质的衰减；(j)由clpA编码的蛋白质的衰减；和(k)由menC编码的蛋白质的衰减；以及(2)选自由如下组成的组的遗传改变(a)由sucCD和yciA编码的蛋白质的衰减；(b)由sucCD和yciA编码的蛋白质的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(c)由sucCD和yciA编码的蛋白质的衰减，并且具有使由cyoB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(d)由sucCD、yciA和cydA或cydB编码的蛋白质的衰减，并且具有使由cyoB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(e)由sucCD、yciA和menC编码的蛋白质的衰减，并且具有使由cyoB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(f)由sucCD、yciA、cydA或cydB和menC编码的蛋白质的衰减，并且具有使由cyoB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(g)由sucCD以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减；(h)由sucCD以及cydA或cydB和pykF编码的蛋白质的衰减；(i)由sucCD以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(j)由sucCD以及cydA或cydB和pykF编码的蛋白质的衰减，以并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(k)由sucCD、yciA以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减；(1)由sucCD、yciA以及cydA或cydB和pykF编码的蛋白质的衰减；(m)由sucCD、yciA以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(n)由sucCD、yciA以及cydA或cydB和pykF编码的蛋白质的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(o)由sucCD、yciA，以及cydA或cydB和menC编码的蛋白质的衰减；(p)由sucCD、yciA以及cydA或cydB和menC编码的蛋白质的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(q)由sucCD和pykF编码的蛋白质的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(r)由clpA编码的蛋白质的衰减；(s)由menC编码的蛋白质的衰减；(t)由menC和cydA或cydB编码的蛋白质的衰减；(u)由pykF和/或pykA编码的蛋白质的衰减；(v)具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(w)cydA或cydB以及sucCD、arcA和crr的衰减，并且具有使由ackA和pta编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(x)cydA或cydB以及arcA的衰减；(y)cydA或cydB的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(z)cydA或cydB以及pykF的衰减；以及(aa)cydA或cydB以及pykF的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.27 US 61/921,292;2014.06.17 US 62/013,3901.一种非天然存在的微生物，其包含选自由如下组成的组的遗传改变：(1)cydA或cydB的衰减，以及选自由如下组成的组的一种或多种遗传改变：(a)使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(b)由pykF编码的蛋白质的衰减；(c)由sucCD编码的蛋白质的衰减；(d)由yciA编码的蛋白质的衰减；(e)使由ackA编码的蛋白质以及由pta编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(f)使由cyoB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(g)由pykA编码的蛋白质的衰减；(h)由arcA编码的蛋白质的衰减；(i)由crr编码的蛋白质的衰减；(j)由clpA编码的蛋白质的衰减；和(k)由menC编码的蛋白质的衰减；以及(2)选自由如下组成的组的遗传改变(a)由sucCD和yciA编码的蛋白质的衰减；(b)由sucCD和yciA编码的蛋白质的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(c)由sucCD和yciA编码的蛋白质的衰减，并且具有使由cyoB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(d)由sucCD、yciA和cydA或cydB编码的蛋白质的衰减，并且具有使由cyoB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(e)由sucCD、yciA和menC编码的蛋白质的衰减，并且具有使由cyoB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(f)由sucCD、yciA、cydA或cydB和menC编码的蛋白质的衰减，并且具有使由cyoB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(g)由sucCD以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减；(h)由sucCD以及cydA或cydB和pykF编码的蛋白质的衰减；(i)由sucCD以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(j)由sucCD以及cydA或cydB和pykF编码的蛋白质的衰减，以并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(k)由sucCD、yciA以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减；(1)由sucCD、yciA以及cydA或cydB和pykF编码的蛋白质的衰减；(m)由sucCD、yciA以及cydA或cydB编码的蛋白质的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(n)由sucCD、yciA以及cydA或cydB和pykF编码的蛋白质的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(o)由sucCD、yciA，以及cydA或cydB和menC编码的蛋白质的衰减；(p)由sucCD、yciA以及cydA或cydB和menC编码的蛋白质的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(q)由sucCD和pykF编码的蛋白质的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(r)由clpA编码的蛋白质的衰减；(s)由menC编码的蛋白质的衰减；(t)由menC和cydA或cydB编码的蛋白质的衰减；(u)由pykF和/或pykA编码的蛋白质的衰减；(v)具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(w)cydA或cydB以及sucCD、arcA和crr的衰减，并且具有使由ackA和pta编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(x)cydA或cydB以及arcA的衰减；(y)cydA或cydB的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变；(z)cydA或cydB以及pykF的衰减；以及(aa)cydA或cydB以及pykF的衰减，并且具有使由pntAB编码的蛋白质的表达增加的遗传改变。2.权利要求1任一项所述的非天然存在的微生物，其进一步包含用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径。3.权利要求2任一项所述的非天然存在的微生物，其中，所述生物衍生化合物选自由如下组成的组：4-羟基丁酸酯(4HB)、1，4-丁二醇(1，4-BDO)、1，3-丁二醇(1，3-BDO)、聚羟基丁酸酯(PHB)、丁二烯、己二酸酯、6-氨基己酸酯、己内酰胺、甲基丙烯酸、异丙醇、长链醇类、六亚甲基二胺、甲基丙烯酸甲酯、丁醇、3-丁烯-1-醇、3-丁烯-2-醇以及巴豆基-醇。4.如权利要求1-2中任一项所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物选自由如下组成的组：细菌、酵母、真菌或适用于发酵过程的其他微生物。5.权利要求4所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物是细菌。6.权利要求5所述的非天然存在的微生物，其中，所述细菌是大肠杆菌。7.权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中，该生物衍生化合物的收率相对于缺乏所述遗传改变是提高的。8.一种生产生物衍生化合物的方法，包含在足以生产所述生物衍生化合物的条件下将权利要求1-7中任一项所述的非天然存在的微生物培养达足够的时间段。9.一种生物衍生化合物，其由权利要求1-7中任一项所述的非天然存在的微生物或通过权利要求8所述的方法产生。10.一种非天然存在的微生物，其包含琥珀酰基-CoA合成酶或转移酶的第一衰减以及琥珀酰基-CoA转化酶或编码在具有琥珀酰基-CoA到琥珀酸的净转化的多步骤途径之内的产琥珀酸酶的基因的至少第二衰减。11.权利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，所述琥珀酰基-CoA合成酶或转移酶由表1、5、6、7、8、9、10或11中所列的基因或与表1、5、6、7、8、9、10或11中所列的基因具有至少70％同一性的直系同源物编码。12.权利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，所述琥珀酰基-CoA合成酶由sucCD编码。13.权利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，所述琥珀酰基-CoA转化酶选自编码表1-11中所列的CoA水解酶、CoA转移酶或CoA合成酶的基因或与表1-11中所列的基因具有至少70％同一性的直系同源物。14.权利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，所述琥珀酰基-CoA转化酶是YciA CoA水解酶。15.权利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，编码在多步骤途径之内的所述产琥珀酸酶的所述基因选自编码表12中所列的一种或多种产琥珀酸酶的基因或与编码表12中所列的所述一种或多种产琥珀酸酶的基因具有至少70％同一性的直系同源物。16.权利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，经由氧化三羧酸(TCA)途径的从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的产量的水平相比没有所述第二衰减的微生物，被减少了25％或更多。17.权利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，相比于没有所述第二衰减的微生物，琥珀酰基-CoA到琥珀酸活性的水平减少了25％或更多。18.权利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，相比于没有所述第二衰减的微生物，从琥珀酰基-CoA到琥珀酸的13C通量的水平减少了25％或更多。19.权利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，相比于没有所述第二衰减的微生物，每个细胞的O2利用率的水平减少了10％或更多。20.权利要求10所述的非天然存在的微生物，其中，相比于没有所述第二衰减的微生物，经由氧化的TCA的过量CO2的水平减少了10％或更多。21.权利要求10所述的非天然存在的微生物，其进一步包含吡啶核苷酸转氢酶的增加的表达。22.权利要求21所述的非天然存在的微生物，其中，所述增加的表达包含上调内源性吡啶核苷酸转氢酶的表达。23.权利要求21所述的非天然存在的微生物，其中，所述吡啶核苷酸转氢酶包含质子-移位转氢酶。24.权利要求21所述的非天然存在的微生物，其中，吡啶核苷酸转氢酶由pntAB编码。25.权利要求10所述的非天然存在的微生物，其进一步包含非琥珀酰基-CoA合成酶或转移酶的TCA循环酶的衰减。26.权利要求25所述的非天然存在的微生物，其中，所述非琥珀酰基-CoA合成酶或转移酶的TCA循环酶选自琥珀酸脱氢酶、富马酸酶和苹果酸脱氢酶。27.权利要求10-26中任一项所述的非天然存在的微生物，其进一步包含用于从TCA循环中间体或TCA循环底物生产生物衍生化合物的代谢工程化途径。28.权利要求10-27中任一项所述的非天然存在的微生物，其中，所述生物衍生化合物选自由如下组成的组：4-羟基丁酸酯(4HB)、1，4-丁二醇(1，4-BDO)、1，3-丁二醇(1，3-BDO)、聚羟基丁酸酯(PHB)、丁二烯、己二酸酯、6-氨基己酸酯、己内酰胺、甲基丙烯酸、异丙醇、长链醇类、六亚甲基二胺、甲基丙烯酸甲酯、丁醇、3-丁烯-1-醇、3-丁烯-2-醇和巴豆基-醇。29.权利要求10-28中任一项所述的非天然存在的微生物，其中包含使NADH脱氢酶Ndh-I、细胞色素bo氧化酶、或NADH脱氢酶Ndh-I和细胞色素bo氧化酶两者的表达增加的遗传改变。30.权利要求29所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含编码所述NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)、细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)、或NADH脱氢酶Ndh-I(nuo)和细胞色素bo氧化酶(cyoABCDE)两者的外源性核酸。31.权利要求10-30中任一项所述的非天然存在的微生物，其进一步包...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·P·博加德，罗宾·E·奥斯特豪特，S·J·万殿，普里蒂·法克雅，梁泰勋，崔正基，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：美国;US