表现出提高的通过发酵途径的通量的重组微生物制造技术

本发明专利技术提供了通过优化酶促反应提高通过发酵途径的通量来提高发酵产物的产生的方法。具体来说，本发明专利技术涉及鉴定参与发酵途径中的代谢瓶颈的酶和/或辅因子，以及使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含CO的基质发酵，所述微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出所述酶中的一种或多种的活性提高，或所述辅因子中的一种或多种的利用率提高。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年6月5日提交的临时申请号61/831,591的优先权，该临时申请的内容在此以引用的方式并入本文。
本专利技术涉及通过优化酶促反应来提高通过发酵途径的通量的方法。更具体地说，本专利技术涉及鉴定和解决发酵途径中的反应瓶颈。
技术介绍
产乙酸型微生物已知可用于通过使包括例如一氧化碳、二氧化碳以及氢气在内的基质发酵来产生燃料和其它化学品(例如乙醇、丁醇或丁二醇)。迄今为止用于提高产物浓度和基质利用率的努力集中在菌株选择、发酵条件和参数的优化以及培养基配方或工艺条件的优化(Abubackar等,2012)。然而，天然生物体的代谢没有进化到实现高收率、速率以及滴度的商业目标(Nielsen,2011)。虽然在生物体中某些反应的速率可以通过优化工艺条件或菌株的选择来提高，但是通常存在不受影响并且将是限速的一些反应。在过去十年中，已经研发出许多硅片上预测工具以研究基因组规模的代谢重建。这些基于约束条件的模型使用化学计量方法来研究通过代谢网络的通量，其中所有可能的净通量分布(可行的通量空间)均由所观测到的细胞输入和输出测量结果(外部通量)以及质量平衡和热力学方程的约束。通量平衡分析(FBA)探测这一解空间以鉴定优化某些目标(通常是使生长达到最大限度)的代谢通量分布。通量平衡分析需要非常少的关于系统中的酶动力学参数和代谢物浓度的信息。然而，这种方法的一个限制因素在于它不能鉴定限速反应(瓶颈)。本专利技术的目的在于提供一种提高发酵反应的效率的方法，或至少为公众提供一个有用的选择。
技术实现思路
在第一个方面，本专利技术提供了一种产生发酵产物的方法，所述方法至少包括以下步骤：a)确定发酵途径中的限速途径反应；b)鉴定参与催化所述限速途径反应的一种或多种酶、辅因子或这两者；c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属(Clostridia)微生物使包含CO的基质发酵，所述微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或ii)b)的一种或多种辅因子的利用率提高，以产生发酵产物。在第二个方面，本专利技术提供了一种提高通过发酵途径的通量的方法，所述方法至少包括以下步骤：a)确定所述发酵途径中的限速途径反应；b)鉴定参与催化所述限速途径反应的一种或多种酶、辅因子或这两者；c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含CO的基质发酵，所述微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或ii)b)的一种或多种辅因子的利用率提高。在第三个方面，本专利技术提供了一种产生重组一氧化碳营养型梭菌属微生物的方法，所述微生物被适配成相对于亲本微生物表现出提高的通过发酵途径的通量，所述方法包括：a)确定所述发酵途径中的限速途径反应；b)鉴定参与催化所述限速途径反应的一种或多种酶、辅因子或这两者；c)使亲本微生物转化以产生重组微生物，所述重组微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或ii)b)的一种或多种辅因子的利用率提高；其中所述发酵途径能够由包含CO的基质产生一种或多种发酵产物。在第四个方面，本专利技术提供了一种产生发酵产物的方法，所述方法包括使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含CO的基质发酵以产生发酵产物，其中所述重组微生物被适配成表现出以下各项中的至少一项：i)在与亲本微生物相比时，被鉴定为参与催化发酵途径的限速途径反应的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或ii)在与亲本微生物相比时，被鉴定为参与催化发酵途径的限速途径反应的一种或多种辅因子的利用率提高。在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成：i)过表达被鉴定为参与催化限速途径反应的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体；或ii)表达被鉴定为参与催化限速途径反应的一种或多种外源性酶；或iii)i)和ii)这两者。在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物已经经受酶工程化以提高酶的活性或提高一种或多种辅因子的利用率，所述酶和所述一种或多种辅因子被鉴定为参与催化限速途径反应。在一个具体的实施方案中，酶工程化的方法选自由以下各项组成的组：定向进化、基于知识的设计、随机诱变法、基因改组、密码子优化、使用位点特异性文库以及使用位点评价文库。在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成相对于亲本微生物表现出所述发酵途径的效率的提高。优选地，所述效率提高包括发酵产物的产生速率的提高。在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，通过分析构成发酵途径的两种或更多种途径反应的酶活性来确定所述限速途径反应。在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述限速途径反应是具有最低的酶活性的途径反应。在第一个方面、第三个方面或第四个方面的一个具体的实施方案中，所述一种或多种发酵产物是乙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、高级醇、丁二醇、2,3-丁二醇、丁二酸盐、类异戊二烯、脂肪酸或生物聚合物中的至少一种。在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述发酵途径是伍德-扬达尔(Wood-Ljungdahl)发酵途径、乙醇发酵途径或2,3-丁二醇发酵途径。在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述一种或多种酶选自由以下各项组成的组：醇脱氢酶(EC1.1.1.1)、醛脱氢酶(酰化)(EC1.2.1.10)、甲酸脱氢酶(EC1.2.1.2)、甲酰基-THF合成酶(EC6.3.2.17)、亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水解酶(EC:6.3.4.3)、亚甲基-THF还原酶(EC1.1,1.58)、CO脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(EC2.3.1.169)、醛铁氧还蛋白氧化还原酶(EC1.2.7.5)、磷酸转乙酰酶(EC2.3.1.8)、乙酸激酶(EC2.7.2.1)、CO脱氢酶(EC1.2.99.2)、以及氢化酶(EC1.12.7.2)。优选地，这个实施方案的微生物被适配成表现出通过引起乙醇产生的发酵途径的通量提高。在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述一种或多种酶选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生发酵产物的方法，所述方法包括：a)确定发酵途径中的限速途径反应；b)鉴定参与催化所述限速途径反应的至少一种酶、辅因子或这两者；c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属(Clostridia)微生物使包含CO的基质发酵，所述微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)(b)的所述至少一种酶或其功能上等同的变体的活性提高；或ii)(b)的所述至少一种辅因子的利用率提高，以产生发酵产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.06.05 US 61/831,5911.一种产生发酵产物的方法，所述方法包括：
a)确定发酵途径中的限速途径反应；
b)鉴定参与催化所述限速途径反应的至少一种酶、辅因子或这两
者；
c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属(Clostridia)微生物使包含
CO的基质发酵，所述微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出以
下各项中的至少一项：i)(b)的所述至少一种酶或其功能上等同的
变体的活性提高；或ii)(b)的所述至少一种辅因子的利用率提高，
以产生发酵产物。
2.一种产生发酵产物的方法，所述方法包括使用重组一氧化碳营
养型梭菌属微生物使包含CO的基质发酵以产生发酵产物，其中所述
重组微生物被适配成表现出以下各项中的至少一项：
a)在与亲本微生物相比时，被鉴定为参与催化发酵途径的限速途
径反应的至少一种酶或其功能上等同的变体的活性提高；或
b)在与亲本微生物相比时，被鉴定为参与催化发酵途径的限速途
径反应的至少一种辅因子的利用率提高。
3.一种产生重组一氧化碳营养型梭菌属微生物的方法，所述微生
物被适配成相对于亲本微生物表现出提高的通过发酵途径的通量，所
述方法包括：
a)确定所述发酵途径中的限速途径反应；
b)鉴定参与催化所述限速途径反应的至少一种酶、辅因子或这两
者；
c)使亲本微生物转化以产生重组微生物，所述重组微生物被适配
成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)(b)的
所述至少一种酶或其功能上等同的变体的活性提高；或ii)(b)的所
述至少一种辅因子的利用率提高；
其中所述发酵途径能够由包含CO的基质产生至少一种发酵产物。
4.一种重组一氧化碳营养型梭菌属微生物，所述微生物是由如权
利要求3所述的方法产生的。
5.一种重组一氧化碳营养型梭菌属微生物，所述微生物被适配成
表现出以下各项中的至少一项：
a)在与亲本微生物相比时，至少一种酶或其功能上等同的变体的
活性提高；
b)在与亲本微生物相比时，至少一种辅因子的利用率提高；或
c)a)和b)这两者；
其中所述至少一种酶或辅因子已经被鉴定为参与催化限速途径反
应。
6.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述限速途径反应是通
过比较所述发酵途径中的两种或更多种途径反应的酶活性并且选择具
有最低酶活性的途径反应来鉴定的。
7.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述微生物被适配成：
i)过表达所述被鉴定为参与催化限速途径反应的至少一种酶或其
功能上等同的变体；
ii)表达被鉴定为参与催化限速途径反应的至少一种外源性酶；或
iii)i)和ii)这两者。
8.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述微生物已经经受酶
工程化以提高所述至少一种酶的活性或提高所述至少一种辅因子的利
用率。
9.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述微生物被适配成相
对于所述亲本微生物表现出所述发酵途径的效率提高。
10.如权利要求9所述的重组微生物，其中所述效率提高包括发酵
产物的产生速率提高。
11.如权利要求10所述的重组微生物，其中所述发酵产物选自由
以下各项组成的组：乙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、高级醇、丁二醇、
2,3-丁二醇、丁二酸盐、类异戊二烯、脂肪酸、生物聚合物、以及其混
合物。
12.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述限速途径反应存在
于伍德-扬达尔发酵途径、乙醇发酵途径或2,3-丁二醇发酵途径中。
13.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述至少一种酶选自由
以下各项组成的组：醇脱氢酶(EC1.1.1.1)、醛脱氢酶(酰化)(EC

\t1.2.1.10)、甲酸脱氢酶(EC1.2.1.2)、甲酰基-THF合成酶(EC6.3.2.17)、
亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水解酶(EC:6.3.4.3)、亚甲基
-THF还原酶(EC1.1,1.58)、CO脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(EC2.3.1.169)、
醛铁氧还蛋白氧化还原酶(EC1.2.7.5)、磷酸转乙酰酶(EC2.3.1.8)、
乙酸激酶(EC2.7.2.1)、CO脱氢酶(EC1.2.99.2)、以及氢化酶(EC
1.12.7.2)。
14.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述至少一种酶选自由
以下各项组成的组：丙酮...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·考普克，A·P·穆勒，
申请(专利权)人：朗泽科技新西兰有限公司，
类型：发明
国别省市：新西兰;NZ