重组代谢微生物及其用途制造技术

萜烯是在多种产业中使用的有价值的商业产品。萜烯可以由石油化学来源和诸如松节油的萜烯原料产生。然而，这些生产方法昂贵，不可持续且常导致环境问题，包括促成气候变化。微生物发酵为萜烯生产提供了一种替代性的选择。可以通过对包含CO的底物的微生物发酵而产生一种或多种萜烯和/或前体。重组微生物可用于此类方法中。一氧化碳营养型产乙酸的重组微生物可用于所述方法中。例如，所述重组微生物可含有外源性甲羟戊酸(MVA)途径的酶和/或DXS途径的酶。

Recombinant metabolizing microorganism and its application

【技术实现步骤摘要】
重组代谢微生物及其用途本申请为分案申请，其原申请的申请日为2013年6月4日，申请号为201380041086.6，名称为“重组代谢微生物及其用途”。
本专利技术涉及重组微生物以及通过对包含CO的底物的微生物发酵产生萜烯和/或其前体的方法。
技术介绍
萜烯是包含五碳异戊二烯单元的天然存在的化合物的多样化类别。萜烯衍生物包括萜类化合物(也称为类异戊二烯)，其可由碳主链的氧化或重排或者大量官能团加成或重排来形成。萜烯的例子包括：异戊二烯(C5半萜烯)、法呢烯(C15倍半萜烯)、青蒿素(C15倍半萜烯)、柠檬醛(C10单萜烯)、类胡萝卜素(C40四萜烯)、薄荷醇(C10单萜烯)、樟脑(C10单萜烯)和大麻素。萜烯是在多种行业中使用的有价值的商业产品。萜烯的最重要用途是作为树脂、溶剂、香料和维生素。举例来说，异戊二烯用于生产例如用于轮胎工业中的合成橡胶(顺-1,4-聚异戊二烯)；法呢烯用作用于运输的能源密集即用燃料(drop-infuel)或用作喷气燃料；青蒿素用作疟疾药物；且柠檬醛、类胡萝卜素、薄荷醇、樟脑和大麻素用于制造药物丁二烯且作为芳族成分。萜烯可以由石油化学来源和萜烯原料(诸如松节油)产生。举例来说，异戊二烯在石油化学上作为乙烯生产中的石脑油或油裂解的副产品而产生。许多萜烯也以相对小的量从自然来源中提取。然而，这些生产方法代价昂贵，不可持续且常导致环境问题，包括引起气候变化。由于异戊二烯的极易燃性质，已知的生产方法需要广泛的保护来限制着火和爆炸的可能性。本专利技术的目标在于克服现有技术的一种或多种不足，或至少向公众提供用于生产萜烯和其它相关产品的替代方式。
技术实现思路
微生物发酵提供了一种用于生产萜烯的替代选择。萜烯在自然界中普遍存在，例如涉及细菌细胞壁生物合成，且它们由一些树(例如白杨)产生用于保护叶片免受UV光暴露。然而，并非所有细菌都包含必要的细胞机制来产生萜烯和/或其前体作为代谢产物。举例来说，尚不知道能够将包含一氧化碳的底物发酵产生诸如乙醇的产物的一氧化碳营养型产乙酸菌(诸如自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)或杨氏梭菌(C.ljungdahlii))会产生且释放任何萜烯和/或其前体作为代谢产物。另外，尚不知道大多数细菌会产生具有商业价值的任何萜烯。本专利技术一般尤其提供通过将包含CO的底物微生物发酵来产生一种或多种萜烯和/或其前体的方法以及用于所述方法中的重组微生物。在第一方面，本专利技术提供能够通过将包含CO的底物发酵产生一种或多种萜烯和/或其前体和任选的一种或多种其它产物的一氧化碳营养型产乙酸的重组微生物。在一个具体实施方案中，将所述微生物改造为适合于表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种在用于产生重组微生物的亲本微生物中不存在的酶(本文中可称为外源性酶)。在另一个实施方案中，将所述微生物改造为适合于过度表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种在用于产生重组微生物的亲本微生物中存在的酶(本文中可称为内源性酶)。在另一个实施方案中，将所述微生物改造为适合于：a)表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种外源性酶和/或过度表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种内源性酶；和b)表达DXS途径中的一种或多种外源性酶和/或过度表达DXS途径中的一种或多种内源性酶。在一个实施方案中，所述来自甲羟戊酸(MVA)途径的一种或多种酶选自：a)硫解酶(EC2.3.1.9)、b)HMG-CoA合酶(EC2.3.3.10)、c)HMG-CoA还原酶(EC1.1.1.88)、d)甲羟戊酸激酶(EC2.7.1.36)、e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC2.7.4.2)、f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC4.1.1.33)，和g)它们的任一种的功能等效变体。在另一个实施方案中，所述来自DXS途径的一种或多种酶选自：a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)、b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)、c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)、d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)、e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)、f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)、g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)，和h)它们的任一种的功能等效变体。在另一个实施方案中，一种或多种其它外源性或内源性酶被表达或过度表达而导致产生萜烯化合物或其前体，其中经表达的外源性酶或经过度表达的内源性酶选自：a)香叶基转移酶(geranyltransferase)Fps(EC:2.5.1.10)、b)七异戊烯基二磷酸合酶(heptaprenyldiphosphatesynthase)(EC:2.5.1.10)、c)八异戊烯基二磷酸合酶(octaprenyldiphosphatesynthase)(EC:2.5.1.90)、d)异戊二烯合酶(isoprenesynthase)(EC4.2.3.27)、e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(isopentenyldiphosphatedelta-isomerase)(EC5.3.3.2)、f)法呢烯合酶(EC4.2.3.46/EC4.2.3.47)，和g)它们的任一种的功能等效变体。在一个实施方案中，亲本微生物能够将包含CO的底物发酵以产生乙酰基CoA，但不能将乙酰基CoA转化成甲羟戊酸或异戊烯基焦磷酸(IPP)，且将重组微生物改造为适合于表达一种或多种在甲羟戊酸途径中所涉及的酶。在一个实施方案中，一种或多种萜烯和/或其前体选自甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯。在一个实施方案中，微生物包含一种或多种被改造为适合于增加一种或多种内源性核酸的表达的外源性核酸且所述一种或多种内源性核酸编码一种或多种前文提到的酶。在一个实施方案中，被改造为适合于增加表达的一种或多种外源性核酸是调节元件。在一个实施方案中，调节元件是启动子。在一个实施方案中，启动子是组成型启动子。在一个实施方案中，启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个实施方案中，微生物包含一种或多种编码且被改造为适合于表达一种或多种前文提到的酶的外源性核酸。在一个实施方案中，微生物包含一种或多种编码且被改造为适合于表达所述酶中至少两种的外源性核酸。在其它实施方案中，微生物包含一种或多种编码且被改造为适合于表达所述酶中至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组微生物，其是通过将编码异戊二烯合酶的核酸引入亲本微生物而制备，所述亲本微生物为自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、大梭菌(Clostridiummagnum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、延长布劳特氏菌(Blautia producta)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、森林乙酸香蕉孢菌(Sporomusa silvacetica)、类球鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)或凯伍热厌氧杆状菌(Thermoanaerobacter kiuvi)，/n其中所述重组微生物能够由至少一种C1化合物生产异戊二烯，所述C1化合物选自一氧化碳和二氧化碳。/n...

【技术特征摘要】
20120601 US 61/654,4121.一种重组微生物，其是通过将编码异戊二烯合酶的核酸引入亲本微生物而制备，所述亲本微生物为自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、德雷克氏梭菌(Clostridiumdrakei)、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、醋酸梭菌(Clostridiumaceticum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、大梭菌(Clostridiummagnum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacteriumwoodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculumbacchii)、延长布劳特氏菌(Blautiaproducta)、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)、热醋穆尔氏菌(Moorellathermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorellathermautotrophica)、卵形鼠孢菌(Sporomusaovata)、森林乙酸香蕉孢菌(Sporomusasilvacetica)、类球鼠孢菌(Sporomusasphaeroides)、普氏产醋杆菌(Oxobacterpfennigii)或凯伍热厌氧杆状菌(Thermoanaerobacterkiuvi)，
其中所述重组微生物能够由至少一种C1化合物生产异戊二烯，所述C1化合物选自一氧化碳和二氧化碳。


2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中将编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的外源酶的核酸进一步引入所述亲本微生物中，其中所述重组微生物能够通过甲羟戊酸途径生产异戊烯基二磷酸；
任选地，其中所述编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的外源酶的核酸选自甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶、硫解酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶和HMG-CoA合酶。


3.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述甲羟戊酸途径为酵母的甲羟戊酸途径，任选地其中所述酵母为酵母属(Saccharomyces)。


4.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其具有一氧化碳脱氢酶。


5.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中将编码在DXS途径中发挥作用的至少一种酶的核酸进一步进入所述亲本微生物中，其中所述DXS途径：
(a)并非天然存在于所述亲本微生物中；或
(b)天然存在于所述亲本微生物中；
任选地其中所述编码在DXS途径中发挥作用的至少一种酶的核酸选自：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS、1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈铱婷，F·刘，M·科普克，
申请(专利权)人：朗泽科技新西兰有限公司，
类型：发明
国别省市：新西兰;NZ