一株重组大肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株重组大肠杆菌及其应用。所述重组大肠杆菌于2018年08月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16349。所述重组大肠杆菌经过发酵培养，上清液中Microcin J25的浓度可达到4000mg/L以上。

A recombinant Escherichia coli and its application

【技术实现步骤摘要】
一株重组大肠杆菌及其应用
本专利技术涉及一种基因工程菌株及其应用，具体地，本专利技术涉及一株高产MicrocinJ25的重组大肠杆菌及其应用。
技术介绍
过度使用抗生素导致的细菌耐药性问题日益突出，使临床抗感染治疗陷入困境。在养殖业，长期使用抗生素促生长剂情况更为严重，不但因抗生素大量残留间接给人类健康带来危害，而且还导致畜禽免疫力低下，增加传染性疾病的发生，加大了养殖成本。大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌容易产生耐药性，由其引起的疾病给畜牧养殖造成了巨大损失，目前迫切需要解决这个问题。抗菌肽(Antimicrobialpeptides，AMPs)是生物进化上最古老的抗微生物感染多肽，也是从原核生物到人等各种生物先天性免疫调节的重要组成部分，是具有直接抗菌和菌群调节作用的固有免疫效应分子。目前的研究表明，抗菌肽具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗原虫、调节机体免疫力等活性，并且不容易产生耐药性。采用基因工程手段改造的大肠杆菌经发酵、分离、纯化得到的MicrocinJ25是抗菌肽的一种。体外抑菌试验表明，MicrocinJ25能够杀灭多种致病性大肠杆菌和沙门氏菌。目前认为MicrocinJ25主要通过以下两种方式抑制病原微生物：1、通过抑制RNA聚合酶活性来干扰细菌mRNA以及蛋白质的合成。2、通过改变细胞膜的通透性，从而是细菌细胞膜破碎，内容物外渗，病原细菌死亡。成熟的MicrocinJ25是由21个氨基酸组成的套索肽，其中N端的第1个氨基酸至第8个氨基酸形成一个圆形环状结构，第9个氨基酸至21个氨基酸形成发夹结构，发夹结构贯穿圆形环状结构，并通过非共价作用将这个尾部固定，理论上这个结构的理化性质非常稳定，能抵御强烈的变性条件，对温度、蛋白酶、酸碱等有良好的耐受性。通过实验证明，MicrocinJ25能耐受121℃高温高压，模拟胃肠液处理后仍具有活性，可见MicrocinJ25适合工业放大生产，并能到达动物肠道后端发挥作用。但至今仍未见MicrocinJ25工业化生产的报道。
技术实现思路
技术目的本专利技术的技术目的是提供一株高产MicrocinJ25的重组大肠杆菌及其应用。技术方案一方面，本专利技术提供一株重组大肠杆菌(Escherichiacoli)ZH021802，其于2018年08月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.16349。在本专利技术的实施方式中，所述重组大肠杆菌ZH021802经过发酵培养，上清液中MicrocinJ25的浓度可达到4000mg/L以上。另一方面，本专利技术提供了上述重组大肠杆菌ZH021802用于生产MicrocinJ25的应用。再一方面，本专利技术提供了一种制备MicrocinJ25的方法，其特征在于，使用上述重组大肠杆菌ZH021802通过发酵得到MicrocinJ25。技术效果与现有技术中表达MicrocinJ25的重组大肠杆菌相比，根据本专利技术的重组大肠杆菌可以极大地提高MicrocinJ25的表达水平，适用于MicrocinJ25的工业化生产。附图说明图1为用于测定制备实施例4制备的MicrocinJ25浓度的标准曲线图。图2为通过元二色谱仪测试制备实施例4制备的MicrocinJ25的测试图谱。具体实施方式以下实施例仅为说明本专利技术的代表性实例，以使本领域的技术人员更好地了解本专利技术，而并非用于限制本专利技术的范围。实验材料模板与菌株大肠杆菌表达MicrocinJ25的DNA模板由郑州众昊生物科技有限公司提供(其全序列参见序列表中SEQIDNo.：1)。大肠杆菌BL21感受态细胞(货号：CD901-03，供货商：北京全金式生物技术有限公司)。大肠杆菌MC4100(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC))。载体pMD18-T克隆载体及pGEX-6p-1表达载体为英俊(Invitrogen)公司产品。制备实施例1目的基因片段的PCR扩增1.目的基因mcjABCD片段全序列(参见序列表SEQIDNo.：1)2.使用的引物如下(下划线表示酶切位点)：上游引物：TAGGATCCCGATGATTAAGCATTTTCATTTTA(SEQIDNo.：2)下游引物：TAGAATTCGCCTGACCGAAGACAATGACTTATT(SEQIDNo.：3)3.PCR反应体系及反应条件表1PCR反应体系成分用量ddH2O36.7μl5％DMSO2.5μl10×Buffer5μl上游引物1μl下游引物1μldNTPs1μlDNA模板2μlTaqE(5U/μl)0.8μl总计50μl表2PCR反应条件制备实施例2将目的片段连接到pMD18-T载体及质粒转化1.酶连反应体系如下表3所示。表3成分用量ddH2O13.5μl10×T4DNALigaseBuffer2μlpMD18-Tvector0.5μlDNA3μlT4DNALigase1μl总计20μl将上述组分混匀后短暂离心，将配好的体系置于16℃稳定过夜。将连接好的体系置于4℃冰箱中备用。2.热击法质粒转化a.从-80℃的冰柜中取出制备好的100μl的大肠杆菌BL21感受态细胞，冰上放置10min，使其进入0℃感受状态。在超净台中，向感受态细胞中分别加入相应的酶连产物(上述制备的连接有目的基因mcjABCD片段的pMD18-T载体)10μl，轻轻旋转并混匀内容物，在冰上放置30min(试验中可设不加质粒的DNA作为对照)；b.热击：用温度计将水浴锅温度准确的调至42℃，将样品取出后马上置于42℃水浴中准确热激90s；c.冰镇：快速将EP管取出搁置冰中，使细胞冷却2min；d.复苏：将400μl已在37℃温箱预热的LB培养基加入到EP管中并在180r/min的37℃摇床上振荡温育1.5h，使细菌复苏；e.布皿：超净台中，取转化后的感受态细胞300μl和150μl分别转移到平皿上，用以无菌弯头玻棒将转化的细胞均匀地涂布到琼脂平板表面；f.培养：将平皿置于37℃温箱中正面培养，直至液体被吸收，然后倒置平皿培养，1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株重组大肠杆菌ZH021802，其于2018年08月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16349。/n

【技术特征摘要】
1.一株重组大肠杆菌ZH021802，其于2018年08月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16349。


2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌ZH021802，其经过发酵培养，上清液中MicrocinJ25的浓度达到4000...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭良兴，
申请(专利权)人：郑州众昊生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41