过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组大肠杆菌的构建方法和纯化方法技术

本发明专利技术公开了过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组大肠杆菌PLY127‑2的构建方法和纯化方法，特点是通过克隆嗜酸乳杆菌ATCC4356的UGPase基因LBA0625片段连接到pET‑28a表达载体上，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，通过红霉素抗性筛选并鉴定获得带有目的基因的重组菌，即过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行诱导后，并利用Ni‑NTA琼脂糖亲和层析成功纯化出UGPase，优点是诱导后的UGPase酶活为456.14IU/L，是对照组的2.34倍，获得的UGPase的活性回收率为53.55%，蛋白纯化倍数为12.96倍。

【技术实现步骤摘要】
过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组大肠杆菌的构建方法和纯化方法
本专利技术属于生物工程及微生物发酵
，具体是涉及过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组大肠杆菌的构建方法和纯化方法。
技术介绍
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase）广泛分布于动物、植物、微生物中，许多物种和组织无论是在转录水平还是蛋白水平上，都有检测到UGPase的存在，这正是由于UGPase在糖代谢中发挥着至关重要的作用。它处于糖代谢的交叉位点，在糖与糖之间的动态转化过程中扮演着重要角色。利用基因工程技术，将外源基因导入大肠杆菌进行过表达，通过简单快速的亲和层析，直接获得纯度较高的目的蛋白。亲和层析具有结合特异性高、纯化条件温和、纯化步骤简单等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决途径。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的纯化方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：1、一种过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625），所述基因来自于嗜酸乳杆菌（lactobacillusacidophilus）ATCC4356编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。2、过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的重组大肠杆菌的构建方法，具体步骤如下：（1）过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的扩增与克隆以嗜酸乳杆菌ATCC4356基因组DNA为模板，设计PCR引物，扩增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625；PCR产物与克隆载体BluntZero以7:1的摩尔比混合，于25℃反应5min后，立即置于冰上，然后将连接产物Blunt-LBA0625转化至Trans1-T1感受态细胞中复制；（2）重组表达载体pET-LBA0625的构建用质粒小量提取试剂盒分别提取克隆质粒Blunt-LBA0625和表达载体pET-28a，均用XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收；将克隆质粒Blunt-LBA0625胶回收产物和表达载体pET-28a胶回收产物以摩尔比7:1在T4连接酶的作用下，于22℃反应30min构建重组表达载体pET-LBA0625；然后将连接产物pET-LBA0625转化至Trans1-T1感受态细胞中复制；（3）重组大肠杆菌PLY127-2的构建提取pET-LBA0625过表达质粒，热激转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布卡那霉素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子；转化子经PCR进行验证，从而获得过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌PLY127-2。PCR引物的序列如下所示：LBA0625上游扩增引物：GGATCCATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGC；LBA0625下游扩增引物：CTCGAGTTATTTATTTTTTCGCTTATCTTCAGCTT。PCR扩增程序如下：（1）94℃4min；（2）98℃10sec，55℃5sec，72℃1min；重复30个循环；（3）72℃5min；PCR反应体系如下所示：5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTPMixture4μL，20mM正向引物1μL，20mM反向引物1μL，模板DNA2μL，PrimeSTARHSDNA聚合酶0.5μL，用蒸馏水补足至50μL。所述表达载体pET-28a的启动子为T7，将目的基因片段插入到pET-28a启动子T7下游多克隆位点。所述的热激转化具体步骤如下：向50μL感受态大肠杆菌BL21（DE3）细胞中加入重组表达质粒pET-LBA0625，轻轻混匀，冰浴30min后，42℃水浴热激45s，然后快速将离心管转移到冰浴中2min；向离心管中加入500μLLB培养基，混匀后至于37℃，200rpm复苏1h，吸取100μL已转化的感受态细胞涂布卡纳霉素抗性LB平板。3、上述过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌的纯化方法，其特征在于具体步骤如下：（1）表达外源蛋白并提取将构建的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌PLY127-2接种于LB肉汤中，于37℃，200r/min过夜活化，制备种子培养液，将种子培养液以体积比8%的接种量接种于LB肉汤培养基中培养至OD600=0.5时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4mM，30℃诱导6h后，于5500rpm离心10min，弃上清；将沉淀菌体用生理盐水洗3次后，然后加入PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎提取蛋白，于10，000×g离心20min后，取其上清，即得到诱导的蛋白上样液；（2）蛋白纯化将his-NTA柱子用结合缓冲液平衡，流速控制在0.5mL/min，然后上样诱导的蛋白上样液，并继续用结合缓冲液清洗至平衡状态，再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，流速控制为1mL/min，用离心管收集洗脱液，取最高峰所对应的管液进行SDS-PAGE电泳纯化回收。所述的结合缓冲液的配方如下：10mM咪唑、20mMTris、0.5MNaCl，pH=8.0；所述的洗脱缓冲液的配方如下：250mM咪唑、20mMTris、0.5MNaCl，pH=8.0。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次公开了一株能过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase）基因的重组大肠杆菌PLY127-2及其构建方法，并建立了纯化UGPase的方法。通过克隆嗜酸乳杆菌ATCC4356（lactobacillusacidophilusATCC4356）的UGPase基因（LBA0625）片段连接到pET-28a表达载体上，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，通过红霉素抗性筛选并鉴定获得带有目的基因的重组菌，即过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的重组大肠杆菌PLY127-2。其外源蛋白得到了高效表达，对重组大肠杆菌进行诱导后，其UGPase酶活为456.14IU/L，是对照组的2.34倍，并利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析成功纯化出UGPase，获得的UGPase的活性回收率为53.55%，蛋白纯化倍数为12.96倍。首次构建了一株能过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌PLY127-2，并成功纯化出UGPase，为高效表达外源蛋白和蛋白纯化奠定研究基础和技术支持。附图说明图1为过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（LBA0625）基因PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果；Lane1、2为目的基因LBA0625PCR扩增后产物；图2为表达载体体pET-28a经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果；Lane1、2为pET-28a经双酶切后的验证结果图；图3为克隆质粒Blunt-LBA0625经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果；Lane1、2为Blunt-LBA0625经双酶切后的验证结果图；图4为pET-LBA0625重组质粒图谱构建流程；图5为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，其特征在于：所述基因来自于嗜酸乳杆菌ATCC 4356编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，其特征在于：所述基因来自于嗜酸乳杆菌ATCC4356编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。2.权利要求1所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于具体步骤如下：（1）过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的扩增与克隆以嗜酸乳杆菌ATCC4356基因组DNA为模板，设计PCR引物，扩增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625；PCR产物与克隆载体BluntZero以7:1的摩尔比混合，于25℃反应5min后，立即置于冰上，然后将连接产物Blunt-LBA0625转化至Trans1-T1感受态细胞中复制；（2）重组表达载体pET-LBA0625的构建用质粒小量提取试剂盒分别提取克隆质粒Blunt-LBA0625和表达载体pET-28a，均用XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收；将克隆质粒Blunt-LBA0625胶回收产物和表达载体pET-28a胶回收产物以摩尔比7:1在T4连接酶的作用下，于22℃反应30min构建重组表达载体pET-LBA0625；然后将连接产物pET-LBA0625转化至Trans1-T1感受态细胞中复制；（3）重组大肠杆菌PLY127-2的构建提取pET-LBA0625过表达质粒，热激转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布卡那霉素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子；转化子经PCR进行验证，从而获得过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌PLY127-2。3.根据权利要求2所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于PCR引物的序列如下所示：LBA0625上游扩增引物：GGATCCATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGC；LBA0625下游扩增引物：CTCGAGTTATTTATTTTTTCGCTTATCTTCAGCTT。4.根据权利要求3所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于PCR扩增程序如下：（1）94℃4min；（2）98℃10sec，55℃5sec，72℃1min；重复30个循环；（3）72℃5min；PCR反应体系如下所示：5×PrimeSTARBuffer10...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭刘杨，曾小群，潘道东，王刚，吴爱娟，吴振，曹锦轩，孙杨赢，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33