一种尿苷二磷酸葡萄糖的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种尿苷二磷酸葡萄糖的制备方法，通过酵母与基因工程菌的联合作用，简便、经济、合理地大量合成尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，然后通过树脂分离、醇沉等进行纯化，可以获得非常高纯度的目标化合物，从而完成了本发明专利技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于化学及生物工程领域；更具体地，本专利技术涉及一种尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的制备方法。
技术介绍
糖核苷酸在功能性寡糖合成，蛋白质、抗生素、黄酮类化合物、青蒿素等结构修饰方面起到了很好的作用。尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是研究最早的糖核苷酸，其可以作为其他种类糖核苷酸合成前体，比如可在UDPG-4′-差向异构酶作用下生成UDP-Gal，在UDPG脱氢酶作用下生成UDP-GlcA等等；黄酮类化合物的修饰主要是以UDPG为底物，在糖基转移酶作用下进行的，比如木犀草素、槲皮素、柚皮素、儿茶素等[中国天然药物，2010，8(5)，389-400]。UDPG的合成主要是化学合成[Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.,28307(1973)、J.Org.Chem.，57146(1992)]、发酵法、酶法转化[J.Org.Chem.，55，1834(1990)、特表平7-500248]。化学合成需要对糖基上活性基团进行保护和去保护，催化剂昂贵，反应条件苛刻，有机溶剂用量大，环境污染严重，反应周期长，得率低。发酵法也存在着产率低的缺点。由于酶对底物具有较强的立体选择性和专一性使酶法合成UDPG成为一种简便易行的方式。而且，近年基因重组技术的快速发展，能够以较低的成本大规模生产各种酶，使酶合成法的优势更为显著。酶法合成糖核苷酸主要是以NTP、葡萄糖-1-磷酸为底物，在相应的焦磷酸化酶作用下生成。如中国科技大学祁超等以UTP、葡萄糖-1-磷酸为底物，通过大肠杆菌表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶合成UDPG，转化率在65～85%[中国科技大学学报，2004，34(5)，624-629]。日本Yamasa公司采用面包酵母生产UDPG，转化率只有28%[US5968783]。日本东京大学研究者Hiroyasu Kawai采用白球拟酵母生产UDPG，转化率在65%，但是会伴随产生部分UDP-Gal，两者很难分离。Agnes W.H.TAN利用纯的己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDPG焦磷酸化酶、焦磷酸化酶合成UDPG，转化率在85%[Biochimica et Biophysica Acta，582(1979)543-547]，但是用纯酶价格比较高，也限制了其工业化生产使用。由于UTP价格昂贵，大多数研究者都利用价格便宜的UMP合成UTP。主要是通过表达核苷酸磷酸激酶的大肠杆菌系统来生产UTP。这需要克隆至少四到六个酶，使得UTP的合成途径繁琐，成本下降不明显。日本Yamasa公司利用酵母系统生成UTP与UDPG的混合溶液，再在大肠杆菌表达的UDPG焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶作用下生成UDPG[US6040158]。但其利用酵母系统合成UTP和UDPG的过程中，会产生一定量的UDP-Gal，而UDPG和UDP-Gal之间很难分离，加重了后续分离工艺的负担。综合以上因素，本领域迫切需要进一步开发高效低成本生产UDPG的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的制备方法。在本专利技术的第一方面，提供一种制备尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的方法，所述方法包括：在一个体外(细胞外)反应系统中，以尿苷三磷酸(UTP)或其盐(如钠盐)、麦芽糊精为底物，加入无机离子、dTT和Tris，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶作为催化剂，通过生物转化生产尿苷二磷酸葡萄糖。在一个优选例中，所述的尿苷三磷酸或其盐(如钠盐)如下制备：将尿苷一磷酸或其盐(如钠盐)、酵母、无机盐和碳源混合、反应，获得尿苷三磷酸或其盐(如钠盐)。在另一优选例中，所述的酵母经过通透性处理，使得酵母与外界的物质交换更为通畅。在另一优选例中，所述的无机离子包括阳离子和阴离子；较佳地，所述的阳离子选自：镁离子、钾离子或钠离子；所述的阴离子是磷酸根离子；更佳地，所述的无机离子由磷酸二氢钾、硫酸镁产生；较佳地，所述的磷酸二氢钾的终浓度为15±10g/L(更佳地为15±8g/L；更佳地为15±5g/L)；较佳地，所述的硫酸镁的终浓度是2.5±1g/L(更佳地为2.5±0.5g/L；更佳地为2.5±0.2g/L)；所述的碳源选自：葡萄糖、果糖或蔗糖；较佳地是葡萄糖；所述的葡萄糖的终浓度是15±10g/L(更佳地为15±8g/L；更佳地为15±5g/L)；所述的尿苷一磷酸或其盐(如钠盐)的终浓度是30±15g/L(更佳地为30±10g/L；更佳地为30±5g/L)；所述的酵母的终浓度是180±100g/L(更佳地为180±60g/L；更佳地为180±20g/L)。在另一优选例中，以大肠杆菌重组表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的方法包括：(1)提供重组表达载体，其中包括尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶编码基因galU(其与驱动表达的元件如启动子操作性连接)；(2)将(1)的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21；(3)培养(2)的重组大肠杆菌BL21，从而表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；较佳地，重组表达时，当菌株在培养基中OD600达到0.6时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0.5mM，诱导后继续培养4小时，收集菌体，破碎，分离上清。在另一优选例中，以大肠杆菌重组表达的麦芽糊精磷酸化酶的方法包括：(a)提供重组表达载体，其中包括麦芽糊精磷酸化酶编码基因malp(其与驱动表达的元件如启动子操作性连接)；(b)将(a)的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21；和(c)培养(b)的重组大肠杆菌BL21，从而表达麦芽糊精磷酸化酶；较佳地，重组表达时，当菌株在培养基中OD600达到0.8时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0.4mM，诱导后继续培养3小时，收集菌体，破碎，分离上清。在另一优选例中，所述反应系统中，尿苷三磷酸或其盐(如钠盐)的终浓度为10±5g/L(更佳地为10±3g/L；更佳地为10±2g/L)；或麦芽糊精的终浓度为22±10g/L(更佳地为22±6g/L；更佳地为22±3g/L)；或大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的终浓度1～50ml/L(相当于0.5-25g菌体)(更佳地为1～30ml/L(相当于0.5-15g菌体)；更佳地为1～10ml/L(相当于0.5-5g菌体))；大肠杆菌重组表达的麦芽糊精磷酸化酶的终浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备尿苷二磷酸葡萄糖的方法，其特征在于，所述方法包括：在一个体外反应系统中，以尿苷三磷酸或其盐、麦芽糊精为底物，加入无机离子、dTT和Tris，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶作为催化剂，通过生物转化生产尿苷二磷酸葡萄糖。

【技术特征摘要】
1.一种制备尿苷二磷酸葡萄糖的方法，其特征在于，所述方法包括：
在一个体外反应系统中，以尿苷三磷酸或其盐、麦芽糊精为底物，加入无
机离子、dTT和Tris，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和
麦芽糊精磷酸化酶作为催化剂，通过生物转化生产尿苷二磷酸葡萄糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的尿苷三磷酸或其盐如下制
备：将尿苷一磷酸或其盐、酵母、无机盐和碳源混合、反应，获得尿苷三磷酸
或其盐。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的无机离子包括阳离子和
阴离子；较佳地，所述的阳离子选自：镁离子、钾离子或钠离子；所述的阴离
子是磷酸根离子；更佳地，所述的无机离子由磷酸二氢钾、硫酸镁产生；较佳
地，所述的磷酸二氢钾的终浓度为15±10g/L；较佳地，所述的硫酸镁的终浓
度是2.5±1g/L；
所述的碳源选自：葡萄糖、果糖或蔗糖；较佳地是葡萄糖；所述的葡萄糖
的终浓度是15±10g/L；
所述的尿苷一磷酸或其盐的终浓度是30±15g/L；
所述的酵母的终浓度是180±100g/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以大肠杆菌重组表达尿苷二磷
酸葡萄糖焦磷酸化酶的方法包括：
(1)提供重组表达载体，其中包括尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶编码基因
galU；
(2)将(1)的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21；
(3)培养(2)的重组大肠杆菌BL21，从而表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化
酶；较佳地，重组表达时，当菌株在培养基中OD600达到0.6时，加入IPTG
诱导，IPTG终浓度为0.5mM，诱导后继续培养4小时，收集菌体，破碎，分
离上清。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以大肠杆菌重组表达的麦芽糊
精磷酸化酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新亮，姚峰，
申请(专利权)人：上海兆维科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31