一种用于合成胞二磷胆碱的生物工程方法技术

本发明专利技术提供一种用于合成胞二磷胆碱的生物工程方法，该方法包括以下步骤：用基因工程方法重组构建含有磷酸胆碱胞苷转移酶的大肠杆菌工程菌株；利用该工程菌株进行大规模高密度培养并分离纯化，得到高纯度、高活性的磷酸胆碱胞苷转移酶；利用磷酸胆碱胞苷转移酶在合适的条件下进行酶法催化合成，得到胞二磷胆碱；在酶法催化合成胞二磷胆碱的体系中加入阳离子交换树脂，使得胞二磷胆碱在合成的过程中不断地被吸附在树脂上，实现胞二磷胆碱反应与分离的耦合。该方法具有底物利用率高、产物回收率高、反应条件温和、反应时间短、对环境污染小、成本低等优点，适合工业化大规模生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种磷酸胆碱胞苷转移酶的制备方法，并通过此酶在体外催化合成胞 ニ磷胆碱，同时实现反应与分离耦合的生物工程方法。该方法可用于胞ニ磷胆碱的大規模生产制备。
技术介绍
胞ニ磷胆碱又称胞磷胆碱钠(cytidine diphosphate choline,简称 ⑶P-Choline，⑶P-C)，其分子式为C14H25N4NaO11P2,分子量为510. 31，呈白色晶体状，并极易溶于水。它是核苷衍生物，是磷脂类磷脂酰胆碱的前体物质，为卵磷脂合成的主要前体。胞 ニ磷胆碱改善脑功能的作用可能与促进卵磷脂的生物合成有夫。其药理作用主要有以下几个方面①能增强脑干网状结构上行激活系统的功能，增强锥体系和抑制锥体外系的作用， 促进催醒和抑制募集反应改善脑血管张カ，降低脑血管阻力，增加脑血流量，改善脑血液循环；③增加脑细胞氧耗，改善脑组织代谢，脑能量代谢等。此外，胞ニ磷胆碱尚有降低高血脂和血小板粘滞度，促进糖代谢和预防黑质内多巴胺生成障碍的作用。目前制备胞ニ磷胆碱的方法有①化学合成法，以CMP、磷酸胆碱(CP)为底物，用对甲苯磺酰氯为缩合剂，在N-ニ甲基甲酰胺(DMF)环境中，化学合成胞ニ磷胆碱；②酶促合成，提取细胞液中的磷酸胆碱胞苷转移酶，并利用三磷酸胞苷和磷酸胆碱合成胞ニ磷胆碱。 但抽提酶液收率低、成本高；③游离酵母合成胞ニ磷胆碱，此法需要大量游离酵母，且产物回收率较低，不适合エ业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种用于合成胞ニ磷胆碱的生物工程方法，g在解决化学合成和生物提取酶法合成胞ニ磷胆碱的种种缺陷，使得胞ニ磷胆碱的制备过程更易进行，产品的收率更高。为了解决上述问题，本专利技术通过以下步骤实现用基因工程方法重组构建含有编码磷酸胆碱胞苷转移酶核苷酸序列的大肠杆菌工程菌株；利用该工程菌株进行大規模高密度培养，井分离纯化得到高活性的磷酸胆碱胞苷转移酶；利用磷酸胆碱胞苷转移酶在合适的条件下进行酶法催化合成，得到胞ニ磷胆碱；更近一歩地在酶法催化合成胞ニ磷胆碱的体系中加入阳离子交换树脂，使得胞ニ磷胆碱在合成的过程中不断地被吸附在树脂上，实现胞ニ磷胆碱反应与分离的耦合。上述的基因工程菌株已于2010年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。建议的分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏号为CGMCC NO: 4428。本专利技术采用胞ニ磷胆碱反应与分离耦合的方法，明显提高了反应和纯化过程的可控性，使得本专利技术适合ェ业化生产。下面结合具体实施例，进ー步阐述本专利技术。附图说明图I是生物催化合成反应前的图；图2是生物催化合成反应后的图。其中图I保留时间为17. 952min的峰为CTP ;图2所示，其中保留时间为7. 150min的峰为胞ニ磷胆碱， 保留时间为18. 049min的峰为CTP，由此可推算出反应的CTP转化率为68%。具体实施例方式实施例I采用常规方法提取肺炎链球菌样品RNA，反转录获得肺炎链球菌cDNA。以权利说明6中所述引物为引物，采用PCR方法从肺炎链球菌cDNA中钓取CCT基因。具体PCR条件为95 °C, 5min ；权利要求1.一种用于合成胞ニ磷胆碱的生物工程方法，其特征在于用基因工程方法重组构建含有编码磷酸胆碱胞苷转移酶核苷酸序列的大肠杆菌工程菌株；利用该工程菌株进行大規模高密度培养，井分离纯化，得到高纯度、高活性的磷酸胆碱胞苷转移酶；利用磷酸胆碱胞苷转移酶在合适的条件下进行酶法催化合成，得到胞ニ磷胆碱；利用分离与反应耦合的エ艺设计，磷酸胆碱胞苷转移酶在具有离子交换树脂的条件下进行酶法催化合成，反应获得的胞ニ磷胆碱被吸附在离子交换树脂上，并可在反应完成后使用具有一定离子强度的缓冲液将其从树脂上洗脱下来，实现胞ニ磷胆碱反应与分离的耦ムロ o2.根据权利要求I所述的生物工程方法，其特征在干所述大肠杆菌工程菌株是含有编码磷酸胆碱胞苷转移酶核苷酸序列的工程菌株，该磷酸胆碱胞苷转移酶的核苷酸序列来源于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae),该基因工程菌株已于2010年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏中心地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。建议的分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏号为CGMCC NO :4428。3.根据权利要求I所述的生物工程方法，其特征在于所述大肠杆菌工程菌株中包含ー种含有磷酸胆碱胞苷转移酶基因序列的原核表达载体 pET28a-CCT。4.根据权利要求3所述的生物工程方法，其特征在干所述的该原核表达载体pET28a-CCT中含有编码磷酸胆碱胞苷转移酶蛋白的一段基因序列(SEQl)。5.根据权利要求4中所述的生物工程方法，其特征在于所述基因序列(SEQl)，其序列信息见说明书。6.一对引物(primerl and primer2),用于扩增权利要求5中所述基因序列的引物,其序列信息上游引物序列5' -ctGAATTCATATG aaagcca tcatcttag-31 ;下游引物序列5' -GtCGTCGACTCGAG attttcgtttttaagaatttc-3'。7.根据权利要求I所述的生物工程方法，其特征在干所述高纯度、高活性的磷酸胆碱胞苷转移酶是通过在改良的培养基中对权利要求I和 2中所述的工程菌株进行大規模高密度培养、井分离和纯化得到的。8.根据权利要求7所述的生物工程方法，其特征在干所述培养基包括胰蛋白胨5-15g/L、酵母抽提物5-15g/L、K2HPO4 3H2010_30g/L、 NaH2PO4 2H20 5_20g/L、以及消泡剂 0. 05% -0. 2% 9.根据权利要求7所述的生物工程方法，其特征在于在接种前还在所述培养基中加入卡那霉素至最终浓度20-100mg/L、无菌MgSO4至终浓度0. 5-1. 5g/L、无菌葡萄糖至终浓度2-10g/L，并将pH值调节至6. 0-7. O。10.根据权利要求7所述的生物工程方法，其特征在于所述高密度培养的方法包括以下步骤在发酵罐中进行补料分批高密度发酵，将PH值控制在6.0-7.0、温度控制在 25 0C _37°C、用于菌体富集的培养时间控制在2-8小吋、IPTG诱导的工作浓度控制在.0.05-lmM，并将诱导时间控制在10-30小时。11.根据权利要求I所述的生物工程方法，其特征在于所述酶法催化合成的方法包括以下步骤以磷酸胆碱、三磷酸胞苷(CTP)为原料，添加镁离子和磷酸胆碱胞苷转移酶，以 Tris-HCl作为缓冲体系，在一定pH值、温度和时间范围内进行反应，并在反应体系中加入阳离子交换树脂。12.根据权利要求11所述的生物工程方法，其特征在于反应液中CTP浓度控制在 10-50mM,磷酸胆碱浓度控制在ATP浓度的2_5倍，氯化镁浓度控制在10_50mM，Tris-HCl浓度控制在50-100mM，磷酸胆碱胞苷转移酶的加入量控制在10-200mg/L，阳离子交换树脂的加入量控制在50-200ml/L，pH值控制在6_8，反应温度控制在20°C _50°C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑春杨，王永宏，刘桂祯，王琳，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，开平牵牛生化制药有限公司，
类型：发明
国别省市：