一种5-甲基四氢叶酸产量提高的枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种5‑甲基四氢叶酸产量提高的枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程领域。本发明专利技术通过代谢改造对DHF合成途径进行强化，增加前体供给；再通过将dCas9蛋白整合到枯草芽孢杆菌基因组中，并诱导表达dCas9蛋白与关键基因序列中的sgRNA结合，阻断前体供给途径、竞争途径及分解代谢途径中的关键基因的转录起始，使基因表达水平下调，得到的一株高产5‑MTHF的重组菌株，产量达到1.58mg/L，是出发菌株的3.9倍，为枯草芽孢杆菌代谢工程高效生产5‑MTHF奠定了基础。

Bacillus subtilis with increased 5-methyltetrahydrofolate production and its application

【技术实现步骤摘要】
一种5-甲基四氢叶酸产量提高的枯草芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及一种5-甲基四氢叶酸产量提高的枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程领域。
技术介绍
L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)是叶酸在人体内发挥作用的惟一活性形式，是叶酸类药物中唯一能透过血脑屏障的药物。叶酸是所有细胞中一碳代谢的辅助因子，它们参与核苷酸的生物合成，叶酸水平不足会使细胞分裂时间延长，从而导致巨幼细胞性贫血；叶酸缺乏还可能导致多种疾病，如孕妇早期自然流产或未出生婴儿脊柱裂和无脑畸形等神经管缺陷(NTD)、听力损失、阿尔兹海默症，心血管疾病等，也会增加癌症的风险。尽管叶酸在人类饮食中无处不在，叶酸缺乏的问题仍然影响着全球数十亿人，叶酸作为食品添加剂已经成为必需品，成人建议摄取叶酸400微克/天，因此导致叶酸的市场需求不断增长。目前5-MTHF生产主要以工业合成为主，但是存在拆分工艺复杂，难以纯化等问题。而且其前体物质叶酸也是通过工业化学合成生产，会对环境造成污染。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别，Bacillussubtilis中存在合成5-MTHF的内源途径，因此运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级5-MTHF的有效途径。然而，枯草芽孢杆菌野生型菌株产量极低，5-MTHF及其中间代谢产物参与途径繁多复杂，传统理性代谢工程调节效率较低。首先强化DHF合成途径，增加前体供给，再利用CRISPRi系统可同时对多个基因的表达进行单独抑制及组合抑制，提高了代谢改造的效率。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种高产5-MTHF的重组枯草芽孢杆菌菌株及其构建方法。构建方法是在低产5-MTHF重组菌株基因组中利用P43强启动子过表达对氨基苯甲酸酯合酶(A亚基)(编码基因pabB)，GTP环化水解酶IA(编码基因folE)，锌非依赖性GTP环化水解酶IB(编码基因yciA)，强化DHF合成途径，增加前体供给；再将dCas9蛋白整合到枯草芽孢杆菌基因组中，并诱导表达dCas9蛋白与关键基因序列中的sgRNA结合，阻断基因的转录起始，使基因表达水平下调，最终实现对竞争和分解代谢途径等的抑制而提高5-MTHF产量。本专利技术的第一个目的是提供一种产5-MTHF的重组枯草芽孢杆菌，强化了DHF合成途径，并抑制中心代谢途径、嘌呤代谢途径、泛酸代谢途径和竞争代谢途径中一个或多个关键基因的表达。在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的出发菌株为B.subtilisA10，已公开于公开号为CN109652351A、专利技术名称为“一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用”的专利申请中；所述强化DHF合成途径是过表达所述DHF合成途径中的对氨基苯甲酸酯合酶A亚基、GTP环化水解酶IA、锌非依赖性GTP环化水解酶IB。在一种实施方式中，利用P43强启动子过表达编码对氨基苯甲酸酯合酶(A亚基)的基因pabB，编码GTP环化水解酶IA的基因folE和编码锌非依赖性GTP环化水解酶IB的基因yciA，以强化DHF合成途径，增加前体供给。在一种实施方式中，所述抑制中心代谢途径、嘌呤代谢途径、泛酸代谢途径和竞争代谢途径中一个或多个关键基因的表达，是将dCas9蛋白整合到枯草芽孢杆菌基因组中，并诱导表达dCas9蛋白与关键基因序列中的sgRNA结合，阻断基因的转录起始，使基因表达水平下调，实现对竞争和分解代谢途径等的抑制而提高5-MTHF产量。在一种实施方式中，所述中心代谢途径的基因包括：调控参与5-MTHF前体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)合成的基因pyk和tkt；所述嘌呤代谢途径的基因包括：调控参与嘌呤代谢的5-MTHF前体10-甲酰四氢叶酸和5,10-亚甲基四氢叶酸的基因purN，purH和thyA；所述泛酸代谢途径包括：调控参与泛酸代谢前体5,10-亚甲基四氢叶酸的基因panB和ykpB；所述竞争代谢途径的基因包括：调控核黄素竞争前体GTP合成的基因ribA，调控参与芳香族氨基酸竞争前体分支酸合成的基因pheA，tyrA和trpE。在本专利技术的一种实施方式中，利用CRISPRi技术抑制的关键基因包括但不限于pyk(编码丙酮酸激酶),tkt(编码转酮醇酶),purN(编码磷酸核糖甘氨酰胺甲酰基转移酶),purH(编码磷酸核糖氨基咪唑羧酰胺甲酰基转移酶和肌苷一磷酸环水解酶),thyA(编码胸苷酸合酶A),panB(编码3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶),ykpB(编码假定的酮戊酸酯还原酶),ribA(编码GTP环水解酶II)，pheA(编码苯甲酸酯脱水酶),tyrA(编码苯甲酸酯脱氢酶)和trpE(编码邻氨基苯甲酸合酶)。在一种实施方式中，编码pabB的基因在NCBI上公开的序列为Bacillussubtilissubsp.subtilisstr.168genome:CP019662.182864to84276，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在一种实施方式中，编码folE的基因在NCBI上公开的序列为Bacillussubtilissubsp.subtilisstr.168genome:CP019662.12384783to2385355，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在一种实施方式中，编码yciA的基因在NCBI上公开的序列为Bacillussubtilissubsp.subtilisstr.168genome:CP019662.1364259to365173，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在一种实施方式中，所述pabB，folE，yciA基因重组于基因组上，并利用P43强启动子整合表达。在一种实施方式中，所述关键基因pyk，tkt，ribA，pheA，thyA，trpE，purH，purN，thyA，panB和ykpB(含其sgRNA非编码链)的核苷酸序列如SEQIDNO.4～14所示。在一种实施方式中，所述基因pyk的sgRNA非编码链序列如SEQIDNO.15～17所示。在一种实施方式中，所述基因tkt的sgRNA非编码链序列如SEQIDNO.18～20所示。在一种实施方式中，所述基因ribA的sgRNA非编码链序列如SEQIDNO.21～23所示。在一种实施方式中，所述基因pheA的sgRNA非编码链序列如SEQIDNO.24～26所示。在一种实施方式中，所述基因thyA的sgRNA非编码链序列如SEQIDNO.27～29所示。在一种实施方式中，所述基因trpE的sgRNA非编码链序列如SEQIDNO.30～32所示。在一种实施方式中，所述基因purH的sgRNA非编码链序列如SEQIDNO.33～35所示。在一种实施方式中，所述基因purN的sgRNA非编码链序列如SEQIDNO.36～38所示。...

【技术保护点】
1.一种产L-5-甲基四氢叶酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，强化了DHF合成途径，并抑制中心代谢途径、嘌呤代谢途径、泛酸代谢途径和竞争代谢途径中一个或多个关键基因的表达；所述强化DHF合成途径是过表达DHF合成途径中的对氨基苯甲酸酯合酶A亚基、GTP环化水解酶IA、锌非依赖性GTP环化水解酶IB。/n

【技术特征摘要】
1.一种产L-5-甲基四氢叶酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，强化了DHF合成途径，并抑制中心代谢途径、嘌呤代谢途径、泛酸代谢途径和竞争代谢途径中一个或多个关键基因的表达；所述强化DHF合成途径是过表达DHF合成途径中的对氨基苯甲酸酯合酶A亚基、GTP环化水解酶IA、锌非依赖性GTP环化水解酶IB。


2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述中心代谢途径的基因包括：调控参与5-MTHF前体磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸合成的基因pyk和tkt；
所述嘌呤代谢途径的基因包括：调控参与嘌呤代谢的5-MTHF前体10-甲酰四氢叶酸和5,10-亚甲基四氢叶酸的基因purN，purH和thyA；
所述泛酸代谢途径包括：调控参与泛酸代谢前体5,10-亚甲基四氢叶酸的基因panB和ykpB；
所述竞争代谢途径的基因包括：调控核黄素竞争前体GTP合成的基因ribA，调控参与芳香族氨基酸竞争前体分支酸合成的基因pheA，tyrA和trpE。


3.根据权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码所述对氨基苯甲酸酯合酶A亚基、GTP环化水解酶IA、锌非依赖性GTP环化水解酶IB的基因重组于基因组上，并利用P43启动子整合表达。


4.根据权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌A10为出发菌株。


5.一种构建权利要求1～3任一所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将编码对氨基苯甲酸酯合酶A亚基的基因pabB整合到枯草芽孢杆菌A10基因组中；
(2)将编码GTP环化水解酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘延峰，刘龙，杨晗，李江华，堵国成，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32