本发明专利技术提供了一种表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其功能验证方法。该技术方案首先将HER2单链抗体的编码基因通过酶切酶连的方法与Igκ载体连接，再利用所得的重组质粒转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，从而得到能够表达HER2单链抗体的重组菌株。本发明专利技术中采用对HER2阳性细胞的定点靶向特性和减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的胞内侵袭、聚集的特性，位点特异性地实现HER2抗体蛋白的表达，从而更准确地杀伤HER2阳性肿瘤细胞，降低对机体正常细胞的损伤。在此基础上，本发明专利技术提供了考察该重组菌抗肿瘤功效的一种实验方法，将活化后的菌株采用灌胃的方式处理乳腺癌动物模型，再考察其肿瘤体积的变化。
Recombinant attenuated Salmonella typhimurium expressing HER2 single chain antibody and its functional verification method
【技术实现步骤摘要】
表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其功能验证方法
本专利技术涉及分子生物学
，进一步涉及生物制药及肿瘤医学技术，具体涉及一种表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其功能验证方法。
技术介绍
目前针对肿瘤的治疗有化学、物理和生物方法等，但上述疗法始终未能达到治疗肿瘤的理想效果，因此探索更安全、更有效地新型肿瘤治疗方法迫在眉睫。自WilliamColey首次利用细菌治疗肿瘤以来，细菌靶向治疗肿瘤己成为近年国际研究的热点，多种细菌被发现可特异性的侵入机体肿瘤组织并大量繁殖，利用活菌治疗肿瘤的设想就随之产生。靶向治疗是指抗肿瘤药物能针对性地与肿瘤的特异性位点结合，从而对肿瘤细胞起到杀伤效果，而对健康组织基本无影响，是目前较为理想的治疗模式，也代表着肿瘤治疗的未来趋势。其主要分为单克隆抗体药和抗体药物偶联物(AntibodyDrugConjugates，ADC)。ADC药物是一类新颖的治疗药物，正日益受到全球制药公司的关注。ADC药物由单克隆抗体和强效毒性药物(toxicdrug)通过生物活性连接器(linker)偶联而成，是一种定点靶向癌细胞的强效抗癌药物。由于其对靶点的准确识别性及非癌细胞不受影响性，极大地提高了药效并减少了毒副作用。在乳腺癌患者中约25％～30％呈现出人表皮生长因子受体-2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，HER2)的过表达，这种类型的乳腺癌通常具有较高的临床及病理分期和较差的预后。HER2也称为受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase，RTK)erbB-2，为HER家族成员之一，主要由胞外域配体结合区、单链跨膜区及胞内域蛋白酪氨酸激酶区这3部分组成。因为无相应配体，通常与HER家族其他成员如表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR/HER1)和HER3等形成二聚体，引起胞内域酪氨酸激酶区的自身磷酸化，启动细胞内信号级联反应，维持细胞的生存与发育，促进细胞增殖和迁移等。HER2的过表达通过启动多种转移相关机制而增加转移能力，HER2过表达的乳腺癌恶性程度相对较高，容易出现淋巴结、骨、肺等处转移，HER2过表达也影响某些黏附分子如上皮细胞钙黏蛋白(E-cadher-in)等合成，从而促进肿瘤细胞的转移。HER2单链抗体能与乳腺癌细胞过表达的HER2进行强有力的结合，从而抑制HER2过表达引起的一系列癌细胞增殖和转移的过程。尽管对乳腺癌具有确切的治疗作用，但常规给药方式下HER2单链抗体在患者体内均匀分布，无法在肿瘤内特异性聚集，使其靶向性有待提升。在这种情况下，如果能对HER2单链抗体进行结构改进，以实现其对实体肿瘤或肿瘤细胞的专一性，那么则有望进一步提升HER2单链抗体的抗肿瘤效果。然而，要实现这一目的，采用化学偶联方法还是微生物重组方法、选择怎样的载体、二者如何实现分子水平的连接，诸多问题尚有待解决。研究发现，鼠伤寒沙门氏菌相较于其他细菌更易于在肿瘤部位定殖。然而其天然菌株毒性强，易造成患者的严重感染。为克服这一安全性差问题，研究人员改造了一系列减毒突变株用于肿瘤靶向治疗，VNP20009就是其中一种研究最广泛的减毒突变株。VNP20009是一种基因修饰的鼠伤寒沙门氏菌菌株，具有极好的安全性，这种安全性特征包括遗传毒性减弱(puri基因缺失)、败血症性休克电位的降低(msbb基因缺失)和抗生素敏感性。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其功能验证方法，以解决现有技术中常规HER2单链抗体无法在肿瘤内特异性聚集的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是，对实体肿瘤具有偏好性的鼠伤寒沙门氏菌，无法在肿瘤中表达HER2单链抗体，以实现抗肿瘤作用。本专利技术要解决的再一技术问题是，对于携带有基因药物的重组微生物，如何验证其抗肿瘤功效。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，该重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是由以下方法构建的：1)将HER2抗体的编码基因片段通过酶切酶连的方法连接到Igκ质粒中，得到Igκ-HER2重组质粒；2)将所述Igκ-HER2重组质粒转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，即为所述表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。作为优选，在于步骤1)中HER2抗体的编码基因片段是核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的DNA片段。作为优选，步骤1)中HER2抗体的编码基因片段是由人工合成获得的。作为优选，步骤1)中HER2抗体的编码基因片段是以核苷酸序列如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的DNA片段为引物，由PCR扩增获得的。作为优选，步骤2)中所使用的Igκ-HER2重组质粒，是先将步骤1)所得的Igκ-HER2重组质粒转入E.coliTop10中，而后培养扩增获得的。作为优选，步骤1)所述的酶切酶连，是以AgeI和HindIII双酶切，酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Igκ质粒中。作为优选，步骤2)包括：采用0.1cm电转杯，以1.8kV，200Ω，25μF，电转4.7ms的条件，将所述Igκ-HER2重组质粒电转至感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中；而后通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，即得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，即为所述表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。作为优选，所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，是通过以下方法制备的：将减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5mLLB培养基中，37℃振荡培养12h；按1:100的比例接种于100mLLB培养基中，振荡培养至细菌OD值为0.4；冰浴20min，而后以4℃、3000rpm离心10min；菌体沉淀用1/10体积预冷的无菌去离子水洗涤两次，4℃、3000rpm离心10min；菌体沉淀再次用1/100体积预冷的10％甘油洗涤菌体，4℃、3000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1/100体积预冷的10％甘油中，即得到所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。作为优选，所述Igκ质粒是核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的DNA分子。在以上技术方案的基础上，本专利技术进一步提供了上述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的抗肿瘤功能验证方法，该方法是将活化后的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，对利用SK-BR-3乳腺癌细胞造模成功的乳腺癌小鼠进行灌胃处理，而后记录肿瘤体积。在以上技术方案的基础上，本专利技术进一步提供了上述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的抗肿瘤功能验证方法，该方法包括以下步骤：1)将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2用L本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于该重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是由以下方法构建的：/n1)将HER2抗体的编码基因片段通过酶切酶连的方法连接到Igκ质粒中，得到Igκ-HER2重组质粒；/n2)将所述Igκ-HER2重组质粒转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，即为所述表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。/n
【技术特征摘要】
1.表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于该重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是由以下方法构建的：
1)将HER2抗体的编码基因片段通过酶切酶连的方法连接到Igκ质粒中，得到Igκ-HER2重组质粒；
2)将所述Igκ-HER2重组质粒转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，即为所述表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。
2.根据权利要求1所述的表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于步骤1)中HER2抗体的编码基因片段是核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的DNA片段。
3.根据权利要求2所述的表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于步骤1)中HER2抗体的编码基因片段是以核苷酸序列如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的DNA片段为引物，由PCR扩增获得的。
4.根据权利要求1所述的表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于步骤2)中所使用的Igκ-HER2重组质粒，是先将步骤1)所得的Igκ-HER2重组质粒转入E.coliTop10中，而后培养扩增获得的。
5.根据权利要求1所述的表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于步骤1)所述的酶切酶连，是以AgeI和HindIII双酶切，酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Igκ质粒中。
6.根据权利要求1所述的表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于步骤2)包括：采用0.1cm电转杯，以1.8kV，200Ω，25μF，电转4.7ms的条件，将所述Igκ-HER2重组质粒电转至感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中；而后通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，即得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈廷涛，王乐，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36
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