灰略红链霉菌果胶裂解酶编码基因及其外源表达和应用制造技术

本发明专利技术公开一种克隆自灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)的新型果胶裂解酶编码基因、体外表达方法及其酶学特征。本发明专利技术通过将果胶裂解酶基因序列连接到表达载体上，进而得到诱导合成果胶裂解酶的转基因重组大肠杆菌。本发明专利技术克服现有技术中由于果胶裂解酶在生物体内酶表达量和活性较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，实现其体外的高效表达。此外，本发明专利技术通过添加可溶性聚组氨酸标签，不仅提高了该重组果胶裂解酶的活性和表达量，而且便于表达产物的后续纯化；测定结果表明，该果胶裂解酶是一种碱性、耐高温裂解酶，对多种重金属离子及酶活性抑制剂具有较强的耐受能力。本发明专利技术为新型果胶裂解酶制剂的开发与制备奠定了重要的基础。

Encoding gene of pectic lyase from Streptomyces gray and its exogenous expression and Application

The invention discloses a cloned from Streptomyces griseorubens (Streptomyces griseorubens) expression of the novel pectate lyase gene encoding, in vitro method and its characterization. The present invention connects the lyase gene sequence to the expression vector, and then obtains the recombinant E. coli which induces the synthesis of pectin lyase. The invention overcomes due to lack of pectate lyase enzyme expression in the application scope and activity resulted in lower and the effect is severely limited, efficient expression in vitro. In addition, the present invention by adding soluble poly histidine tag, and not only improve the expression of the recombinant pectate lyase activity, but also facilitate the expression product of subsequent purification; results showed that the pectin lyase is an alkaline, high temperature resistant lyase, a variety of heavy metal ions and enzyme inhibitor has strong tolerance ability. The invention lays an important foundation for the development and preparation of a new type of pectin lyase preparation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种克隆自灰略红链霉菌的果胶裂解酶编码基因序列、含有该基因序列的表达载体、转基因表达菌株和重组果胶裂解酶的特殊酶学活性。
技术介绍
果胶酶是广泛存在于果实及多种微生物可以作用于果胶质的一类由许多单酶组成的复合酶的总称。果胶酶在苎麻脱胶、木材防腐和酒精发酵等领域具有主要的应用意义，目前已广泛应用于食品行业。果胶裂解酶是果胶酶的重要组成部分，能催化聚半乳糖醛酸α-1，4键的断裂，是一种能降解植物细胞壁，导致植物组织软化甚至死亡的解聚酶。果胶裂解酶作用于半乳糖醛酸的第5位β-碳原子，使β-碳原子上的氢原子转移到糖苷键的氧原子上，糖苷键断裂，在半乳糖醛酸的C-4和C-5之间形成双键。果胶裂解酶在果汁澄清、酶法浸解、酶法提取果汁技术方面的应用广泛，特别是在食品行业中果汁、果酒的澄清及提高水果出汁率等方面具有重要作用。近期研究发现，果胶裂解酶还可以用于植物病毒的纯化、纸浆漂白剂纺织品的生物精炼等，为果胶裂解酶在减少环境污染和降低能源消耗方面的研究指明了新方向。自20世纪90年代以来，人们把研究重点从筛选产碱性果胶酶的菌种逐步转向产果胶裂解酶基因及基因工程上，尤其是随着新型碱性果胶酶产品的快速发展，人们将注意力越来越多的注意力转向了酶的提纯、基因及其克隆技术的研究。果胶裂解酶来源广泛，细菌、真菌和放线菌都已产生果胶裂解酶，但是能产生果胶裂解酶并成功应用于工业生产的实例还很少。研究表明，链霉菌是合成果胶裂解酶的理想菌株。本专利技术针对一种克隆自灰略红链霉菌的新型果胶裂解酶，对其进行原核表达分析及初步酶学性质分析，为该果胶裂解酶的异源重组表达及生产利用提供了有效的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种灰略红链霉菌果胶裂解酶。本专利技术的另一目的在于提供上述果胶裂解酶的编码基因。本专利技术的另一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体或重组大肠杆菌。本专利技术的另一目的在于提供一种上述的果胶裂解酶编码基因在表达果胶裂解酶中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种利用上述转基因重组大肠杆菌诱导发酵果胶裂解酶的方法。本专利技术的目的是通过以上技术方案实现：一种灰略红链霉菌果胶裂解酶，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。一种上述灰略红链霉菌果胶裂解酶的编码基因。一种含有所述的果胶裂解酶的编码基因的重组表达载体。一种含有所述的果胶裂解酶的编码基因的大肠杆菌重组菌株。所述的果胶裂解酶及其编码基因克隆自灰略红链霉菌，所述的果胶裂解酶呈现SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，该果胶裂解酶由序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码。所述的SEQIDNO.1克隆自灰略红链霉菌(Streptomycesgriseorubens)，命名为JSD-1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.5706，保藏日期为2012年1月9日。本专利技术所述的果胶裂解酶基因序列是通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得。本专利技术涉及的实验技术包括链霉菌基因组及大肠杆菌质粒DNA的提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶回收、连接、质粒酶切、转化、蛋白诱导表达及纯化、聚丙烯酰胺凝胶电泳及重组果胶裂解酶活性的测定等。具体步骤为：以灰略红链霉菌基因组为模板，通过PCR扩增获得该果胶裂解酶编码基因序列，随后将该基因序列连接到表达载体pET-22b(+)上并将重组质粒转化到特定的大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)内，进而获得果胶裂解酶表达菌株，最终通过IPTG诱导实现果胶裂解酶的体外高效表达。收集菌体细胞破碎，离心后获得粗酶液后进行蛋白纯化并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和WesternBlot检测表达情况。最后，测定该果胶裂解酶相关的酶学特征。该果胶裂解酶的编码基因共有1284个核苷酸，序列如SEQIDNO.1，共编码427个氨基酸，序列如SEQIDNO.2所示。所述的重组表达载体为：将所述的果胶裂解酶的编码基因插入大肠杆菌表达载体，进而得到表达果胶裂解酶的重组表达载体；所述的大肠杆菌表达载体为pET-22b(+)载体。所述的大肠杆菌重组菌株为：将含有所述的果胶裂解酶的编码基因的重组表达载体导入大肠杆菌宿主细胞进而得到转基因重组菌株；所述的大肠杆菌宿主细胞为Transetta(DE3)。所述的果胶裂解酶的编码基因在表达果胶裂解酶中的应用。一种表达果胶裂解酶的方法，为培养所述的大肠杆菌重组菌株得到果胶裂解酶。果胶裂解酶在生物体内表达量和酶活性较低，因此严重限制了其使用范围和效果，本专利技术利用基因工程手段，构建了果胶裂解酶表达工程菌株，大幅度提高了目的蛋白的表达量，为该果胶裂解酶的高效表达与应用奠定了基础。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：1.本专利技术提供了一种新型耐高温碱性果胶裂解酶及其编码基因的核苷酸序列；2.本专利技术通过构建外源表达载体，实现了上述果胶裂解酶的体外高效表达，并通过添加可溶性标签聚组氨酸标签，保证生物学活性的同时方便后续蛋白的纯化；3.本专利技术通过载体信号肽实现了目的产物的周质空间表达，保证了果胶裂解酶的活性；4.本专利技术所述的果胶裂解酶在特殊条件(如高温、碱性、重金属离子及酶活性抑制剂)下具有较稳定的生物学活性。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。附图说明图1是本专利技术实施例的果胶裂解酶信号肽切除位点预测图；图2是本专利技术实施例的果胶裂解酶外源诱导表达示意图；图3是本专利技术实施例的pH对果胶裂解酶活力影响示意图；图4是本专利技术实施例的温度对果胶裂解酶活力影响示意图。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步说明，下述实验和实例所述内容属于本专利技术的主要内容，有些对本领域专业人员来说属于常规的实验方法并未在本专利说明书中出现。实施例步骤1灰略红链霉菌基因组提取和测序将灰略红链霉菌孢子悬浮液接种于LB液体培养基中，于37℃、150rpm条件下培养3天，然后收集2.0mL菌液，12000rpm离心2min。弃上清，收集菌体沉淀，加入180μL溶菌酶(20mg/mL)和20μlEDTA溶液(0.5M,pH8.0)，37℃处理45min，加入4μLRNaseA(100mg/mL)，震荡混匀15s，室温放置5min，随后按照细菌DNA提取试剂盒操作说明完成剩余操作，得到高纯度基因组DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量，测试结果无明显RNA条带，基因组条带清晰、完整、无降解、无污染。采用第二代测序技术，构建不同插入片段长度的文库，采用IlluminaMiseq(2×250bp)平台进行测序，收集测序的原始数据，对带接头、低质量的数据进行过滤，随后采用Newblerversion2.8对去除接头的测序数据进行从头拼接，构建Contigs及Scaffolds，最后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。步骤2果胶裂解酶切割位点预测基于基因功能注释，在该菌株基因组获得果胶裂解酶编码基因。采用SignalP4.1分别对果胶裂解酶氨基酸序列进行信号肽模拟预测，如图1所示。结果表明果胶裂解酶N端存在明显的信号肽序列，推测该酶为胞外酶，且信号肽切割位点位于第19位丙氨酸与第20位组氨酸之间。步骤3果胶裂解酶表达载体构建根据果胶裂解酶基因序列，设计含有酶切位点的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种灰略红链霉菌果胶裂解酶，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

【技术特征摘要】
1.一种灰略红链霉菌果胶裂解酶，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。2.权利要求1所述的果胶裂解酶的编码基因。3.如权利要求2所述的果胶裂解酶的编码基因，其特征在于，具有序列表中的SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。4.一种含有权利要求2或3所述的果胶裂解酶的编码基因的重组表达载体。5.一种含有权利要求2或3所述的果胶裂解酶的编码基因的大肠杆菌重组菌株。6.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，将所述的果胶裂解酶的编码基因插入大肠杆菌表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：周培，支月娥，冯海玮，孙玉静，毛亮，聂文翰，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31