新放线菌素A及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及新放线菌素A及其制备和合成方法，以及这个化合物在抗耐药菌及抗肿瘤中的应用，所述新放线菌素A系源于海洋链霉菌IMB094(Streptomyces sp.IMB094)的发酵产物，实验研究结果证明，新放线菌素A，对所试革兰氏阳性耐药菌具有很强的抗菌活性，对所试肿瘤细胞具有很强的抑制作用，有望成为临床有用的抗耐药菌及抗肿瘤新药物。

New actinomycin A, preparation method and application thereof

The present invention relates to novel actinomycin A and its preparation and synthesis method, and the application of this compound in anti drug resistant and anti tumor, the new actinomycin A from marine Streptomyces IMB094 (Streptomyces sp.IMB094) the fermentation products, the experimental results prove that, the new actinomycin A that has a strong antibacterial activity against tested gram positive strains, with a strong inhibitory effect on the tumor cells, is expected to become clinically useful against resistant bacteria and anti tumor drugs.

【技术实现步骤摘要】
新放线菌素A及其制备方法和用途
：本专利技术属于医药生物领域，涉及从海洋微生物获得新结构放线菌素衍生物新放线菌素A；及其制备方法和药物应用。
技术介绍
：目前细菌耐药日益严重，研发新的抗生素迫在眉睫。放线菌素(英文名称：(Actinomycins)是一类色素肽类抗生素，由生色团母核吩噁嗪酮发色团通过酰胺键与两个五肽内酯环相连组成，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗结核活性[袁薇,焦伟华,王颖,等.放线菌素生物合成研究进展[J].氨基酸和生物资源,2014,36(1):1-7；Anthony,B.M.；Helmut,L.TheActinomycins.InAnticancerAgentsfromNaturalProducts,SecondEdition,CRCPress:2011；pp363-382.]。近年来，本实验室从海洋微生物资源中研发出一系列具有生物活性的物质的放线菌素，其中发现新化合物、新天然产物以及该新型天然产物的半合成方法。至今为止，自链霉菌属、小单孢菌属和类诺卡氏菌属等放线菌中发现了30多种天然放线菌素。放线菌素广泛分布链霉菌属各个种，比如抗生链霉菌(S.antibioticus)，小链霉菌(S.parvulus)，金羊毛链霉菌(S.chrysomallus)，绿青链霉菌(S.iakyrus)，弗氏链霉菌(S.fradiae)，灰色链霉菌(S.griseus)，稠李链霉菌东方变种(S.padanus)等。不仅在陆地上，分离自海绵的放线菌sh6004中也发现了放线菌素的存在[孙肇暘,杨秀萍.放线菌素研究进展[J].首都师范大学学报自然科学版,2011,32(1):54-59.]。本专利技术从一株来源于海洋放线菌链霉菌IMB094(Streptomycessp.IMB094)的发酵液活性成分中，分离获得新结构放线菌素衍生物，新放线菌素A(Neo-actinomycinsA，化合物1，式I)。此外，以放线菌素D为原料，利用化学反应合成式I所示化合物1。体外抗菌活性表明，化合物1对包括MRSA(甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌)、MRSE(甲氧西林耐药表皮葡萄球菌)、VRE(万古霉素耐药粪肠球菌、屎肠球菌)等多种耐药菌具有较好的抗菌活性。体外细胞毒性表明，化合物1对A549细胞(人肺腺癌细胞)和HCT116(人结肠癌细胞)和HepG2(人肝癌细胞)具有良好的细胞毒性。涉及化合物1的化学结构、制备方法、半合成方法、生物合成途径以及抗耐药菌和抗肿瘤活性，迄今为止，尚未见有关报道。
技术实现思路
：本专利技术目的之一是，提供一株产生放线菌素衍生物(新放线菌素A)的产生菌：海洋放线菌链霉菌，生物保藏编号为CGMCC13680。本专利技术目的之二是，提供一种放线菌素衍生物，新放线菌素A。本专利技术从海洋放线菌IMB094(Streptomycessp.IMB094)的发酵产物中发现的新放线菌素A，其结构如式Ⅰ所示。化合物1：新放线菌素A(Neo-actinomycinsA)分子式C66H90N12O18，分子量1339。本专利技术目的之三是，提供新放线菌素A的制备方法。本专利技术所述的新放线菌素A的制备方法，包括以下步骤：(1)将生物保藏编号为CGMCC13680的海洋放线菌链霉菌IMB094菌种接种于配方为淀粉-葡萄糖-棉籽饼粉-蛋白胨-无机盐的发酵培养基，在摇瓶中，28℃，摇床培养120h；(2)链霉菌(Streptomycessp.)IMB094发酵液经固液分离后得到滤液和菌丝体；菌丝体用丙酮超声提取，得到菌丝体丙酮提取物；滤液经过大孔吸附树脂柱吸附，依次用水、丙酮洗脱；丙酮洗脱部分与菌丝体丙酮提取物合并，减压浓缩除去丙酮后得到发酵液浸膏；(3)取发酵液浸膏，经正相硅胶柱色谱分离，依次用二氯甲烷-甲醇(50:1-0:100)梯度洗脱，得到10个组分(F1-F10)；取馏分F5，F6和F7分别经过色谱柱色谱分离，用甲醇洗脱，然后经HPLC制备得到含有式Ⅰ所示化合物的混合物，混合物经过HPLC进行纯化得到式I所示化合物。优选的，本专利技术所述的新放线菌素A的制备方法，包括以下步骤：(1)将生物保藏编号为CGMCC13680的海洋放线菌链霉菌IMB094菌种接种于配方为淀粉-葡萄糖-棉籽饼粉-蛋白胨-无机盐的发酵培养基，在摇瓶中，28℃，摇床培养120h；(2)链霉菌(Streptomycessp.)IMB094发酵液经固液分离后得到滤液和菌丝体；菌丝体用丙酮超声提取，得到菌丝体丙酮提取物；滤液经过XAD-7HP大孔吸附树脂柱吸附，依次用水、50％丙酮、90％丙酮洗脱；50％丙酮、90％丙酮洗脱部分与菌丝体丙酮提取物合并，减压浓缩除去丙酮后得到发酵液浸膏；(3)取链霉菌(Streptomycessp.)IMB094发酵液浸膏(25g)，经正相硅胶柱色谱分离，依次用二氯甲烷-甲醇(50:1-0:100)梯度洗脱，得到10个组分(F1-F10)；取馏分F5(20:1洗脱,0.36g)，F6(9:1洗脱,0.54g)，和F7(9:1洗脱,0.65g)分别经过SephadexLH-20柱色谱柱色谱分离，用90％甲醇洗脱，然后经HPLC分离纯化得到混合物，将混合物在经过HPLC进行分离纯化，收集高分辨电喷雾质谱准分子离子峰m/z1339.6542的峰得到式I所示化合物。步骤3)中，馏分F4、F5为二氯甲烷-甲醇(20:1)分别依次洗脱4.0L得到，馏分F6、F7为二氯甲烷-甲醇(9:1)依次洗脱4.5L得到。其中，第1次HPLC分离纯化过程如下：C-18色谱柱，5μm,20mm×250mm,75-100％甲醇线性梯度60min洗脱,10mL/min。其中，第2次HPLC分离纯化过程如下：C-18色谱柱，10mm×250mm，58％MeCN含0.5％甲酸洗脱,2mL/min。58％MeCN含0.5％甲酸：浓度为58％的乙腈溶液中，含有浓度为0.5％的甲酸。其中，制备方法中使用的链霉菌，优选为链霉菌(Streptomycessp.)IMB094，系分离自中国大连黄海黑石礁海湾深度约40m的海底沉积物，该细胞株已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.13680，保藏日期2017年2月24日，分类命名：链霉菌，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。链霉菌(Streptomycessp.)IMB09416SrDNA基因序列如SEQIDNO.1所示，提交NCBI，GenBank编号为KY111376。本专利技术从海洋放线菌链霉菌(Streptomycessp.)IMB094的发酵产物中，还发现式II所示化合物2、放线菌素D和X2。化合物2曾有文献报道通过化学合成得到[Sengupta,S.K.etal.J.Med.Chem.1983,26,1631；Sengupta,S.K.AnticanceractinomycinDanalogs.US4562176A,1985]。文献中报道了该化合物的化学结构、紫外光谱和分子式信息，没有氢谱、碳谱等核磁共振波谱数据。由于化合物2作为天然产物是首次发现，因此命名为新放线菌素B。化合物2：新放线菌素B(Neo-actinomycinsB)分子式C64H88N12O16，分子量1281。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种放线菌素衍生物新放线菌素A，其结构如式Ⅰ所示：

【技术特征摘要】
1.一种放线菌素衍生物新放线菌素A，其结构如式Ⅰ所示：2.权利要求1所述新放线菌素A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将生物保藏编号为CGMCCNo.13680的海洋放线菌链霉菌IMB094菌种接种于配方为淀粉-葡萄糖-棉籽饼粉-蛋白胨-无机盐的发酵培养基，在摇瓶中，28℃，摇床培养120h；(2)链霉菌IMB094发酵液经固液分离后得到滤液和菌丝体；菌丝体用丙酮超声提取，得到菌丝体丙酮提取物；滤液经过大孔吸附树脂柱吸附，依次用水、丙酮洗脱；丙酮洗脱部分与菌丝体丙酮提取物合并，减压浓缩除去丙酮后得到发酵液浸膏；(3)取发酵液浸膏，经正相硅胶柱色谱分离，依次用二氯甲烷-甲醇＝50:1-0:100进行梯度洗脱，得到10个组分F1-F10；取馏分F5(20:1洗脱)，F6(9:1洗脱)和F7(9:1洗脱)分别经过色谱柱色谱分离，用甲醇洗脱，然后经HPLC制备得到含有式Ⅰ所示化合物的混合物，混合物经过HPLC进行纯化得到式I所示化合物。3.权利要求1所述新放线菌素A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将生物保藏编号为CGMCC13680的海洋放线菌链霉菌IMB094菌种接种于配方为淀粉-葡萄糖-棉籽饼粉-蛋白胨-无机盐的发酵培养基，在摇瓶中，28℃，摇床培养120h；(2)链霉菌IMB094发酵液经固液分离后得到滤液和菌丝体；菌丝体用丙酮超声提取，得到菌丝体丙酮提取物；滤液经过XAD-7HP大孔吸附树脂柱吸附，依次用水、50％、90％丙酮洗脱；50％、90％丙酮洗脱部分与菌丝体丙酮提取物合并，减压浓缩除去丙酮后得到发酵液浸膏；(3)取发酵液浸膏，经正相硅胶柱色谱分离，依次用二氯甲烷-甲醇(50:1-0:100)梯度洗脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：甘茂罗，王强，王冕，胡媛媛，谭亿，何红伟，王以光，肖春玲，周红霞，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11