本发明专利技术公开了一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌Streptomyces hydrogenans OsiLf‑2，菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.11673。该菌体外能对至少5种不同生理小种的稻瘟病菌有很好的拮抗作用。其发酵液也具有较强的拮抗稻瘟病菌能力，而且抗菌活性很稳定。该菌或其发酵液在生物防治水稻稻瘟病、开发新型安全无毒的绿色农药等方面具有较大的应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物内生放线菌与生物防治领域，具体涉及一株具有拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌的分离及抗性相关研究。
技术介绍
水稻稻瘟病是指由稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）引起的一种水稻真菌病害。稻瘟病菌生存能力很强及传播广泛的特点，使其成为对水稻危害最为严重的病害之一。目前对稻瘟病的防治主要包括抗病品种选育和药剂防治。但是长期大量使用化学农药，污染环境，损害人类健康，还导致病原菌产生抗药性。稻瘟病菌的遗传背景复杂且易变异，使得水稻抗病品种难以跟上致病菌生理小种的变异速度，在3-5年后就丧失抗病性。而采用以农业可持续化发展为宗旨的生物防治方法，利用有益微生物及其代谢产物控制稻瘟病菌，相对来说更加安全高效。内生菌是可以在其整个或部分生长周期中稳定定殖在植物内部的微生物菌群。与根际和土壤微生物相比，内生菌生长在植物内部而不会与土壤菌产生生存竞争。而且，内生菌在长期的协同进化过程中，与植物形成了互利互惠的关系。它可以直接抵抗病菌的侵染或通过促进寄主植物的生长或诱发免疫反应来间接提高植物抗病性。目前报到的用于稻瘟病生物防治的抗病性内生菌大多是易培养的细菌和真菌类群，较难分离的内生放线菌则报道较少。但放线菌作为抗生素的主要来源，其生防潜能更大。
技术实现思路
本专利技术提供了一株具有防治稻瘟病潜力的水稻内生放线菌OsiLf-2，该菌株分离自稻瘟病发病区的水稻叶部，已于2015年11月16日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCCNo.11673，分类命名为产水链霉菌Streptomyceshydrogenans，专利技术人将其命名为OsiLf-2，经检测存活。该菌16sRNA的Genbank登录号为KU350524。本专利技术所得菌株生长能力较强，易于培养。在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上生长时，气生菌丝黄白色，呈放射状生长，分枝较多，不产生可溶性色素。扫描电镜观察发现其孢子呈连续棒状结构。该菌株在pH为6.0-12.0和温度为20℃-40℃环境中均可良好生长；能使淀粉水解，酪蛋白水解，明胶液化，能产生过氧化氢酶；能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、半乳糖、甘露醇、柳醇。专利技术所得菌株能对至少5种不同生理小种的稻瘟病菌有较好拮抗作用，能明显抑制菌丝生长，其对稻瘟病菌生长抑制率最高达83%。专利技术所得菌株发酵液有较好的抗稻瘟病菌活性，培养温度为35℃或培养基pH为7的发酵液抗稻瘟病菌活性较好。当其生长量达到最大时，其发酵液的抗稻瘟病菌能力也基本达到最强，其后随着培养时间的增加，抗性也能保持稳定。发酵液用蛋白酶K、低温、强光照和紫外处理一个小时仍然保持完整的活性；100℃处理一个小时仍然保留了大部分的活性；强酸和强碱处理一个小时，也能保持较好的抗菌活性。上述特征表明本专利技术提供的内生放线菌OsiLf-2，具有较强的抗真菌活性，且其抗菌成分药效持久、稳定，在生物防治水稻稻瘟病和开发新型、高效的农用新药物等方面具有较大的开发潜力。附图说明图1：本专利技术菌株OsiLf-2的菌落形态图（A）及扫描电子显微镜观察图（B）；图2：本专利技术菌株OsiLf-2的系统进化树；图3：本专利技术菌株OsiLf-2对5种不同生理小种稻瘟病菌的抑制情况，A-E.稻瘟病菌对照；F-J.OsiLf-2对5种不同生理小种的稻瘟病菌的抑制；图4：稻瘟病菌RB3在扫描电子显微镜下，未经OsiLf-2处理（A）和经OsiLf-2处理的（B）菌丝体形态；图5：本专利技术菌株OsiLf-2在不同培养条件下的生长量及抗稻瘟病菌活性（A.不同培养时间；B.不同培养基pH；C.不同培养温度）。具体实施方式实施例1：OsiLf-2菌株的分离、纯化和筛选取湖南亚华种业科学研究院浏阳大围山基地易感籼稻品种，将发病不严重的叶片洗净，植物表面消毒，干燥后置于甘露醇大豆琼脂培养基（MS）上，置于27℃培养，待内生放线菌长出，再结合划线分离法在固体马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上获得其纯培养物。采用平板对峙法，将分离得到的菌株与稻瘟病菌同时接种到PDA固体平板上，放入霉菌培养箱中28℃倒置培养，每天观察，筛选出拮抗真菌效果最明显的菌株OsiLf-2，其对稻瘟病菌菌丝抑制率最高达83%，见附图3。实施例2：OsiLf-2菌株的生物学鉴定1．菌株形态特征（1）菌落形态特征：将OsiLf-2单菌落划线接种至PDA固体培养基中，将平板倒置于恒温培养箱，28℃培养，3天以内长出无色基生菌丝和气生菌丝，菌落表面平滑、边缘呈褶皱。3天后长出黄白色白色孢子覆盖在菌落上。见附图1A。（2）菌体形态特征：用插片法培养该菌，在电子显微镜下观察其气生菌丝及孢子情况，见附图1B。2.OsiLf-2菌株16SrRNA分析采用革兰氏阳性菌基因组DNA提取试剂盒（ShanghaiGenerayBiotechCo.,Ltd）的方法，抽提菌株基因组DNA，以该DNA为模板，采用放线菌16SrRNA基因引物（27F-765R及704F-1492R），扩增出菌株的16SrRNA片段并测序，将得到的16SrRNA序列与Eztaxon的核酸数据库进行Blast同源性比对(http://www.ezbiocloud.net)，与数据库中已知放线菌Streptomyceshydrogenans的16SrRNA全长序列的相似性达到了100%，保守区序列的相似性达到100%，将该菌株鉴定为链霉菌属，命名为产水链霉菌StreptomyceshydrogenansOsiLf-2。使用软件MEGA5.0采用邻近结合法（neighbor-joiningmethod）制作OsiLf-2的系统进化树，见附图2。实施例3：OsiLf-2菌株对不同生理小种稻瘟病菌的抑制采用平板对峙法，在直径为90mm的培养皿中心接种不同生理小种稻瘟病菌。其中RB3，61，62，SO7来自湖南亚华种子有限公司，Guy11来自湖南省农业科学院。刮取活化好的OsiLf-2在距离病原真菌30mm的位置上划一直线。28℃倒置培养7天以上，结果见附图3，OsiLf-2对稻瘟病菌RB3、61、62、Guy11、SO7的抑制率分别为74.1%、74.6%、82.9%、83.0%、80.6%。实施例4：OsiLf-2菌株对稻瘟病菌RB3菌丝体的影响取平板对峙实验中接近放线菌边缘和对照组中相对应位置的稻瘟病菌RB3菌块，经过戊二醛和锇酸固定后，洗脱干燥处理并喷金，置于扫描电子显微镜下观察菌丝体的形态变化，结果见附图4，可见经OsiLf-2处理后的稻瘟病菌RB3的菌丝体出现了明显的畸形和菌丝断裂。实施例5：OsiLf-2菌株在不同培养条件下的生长情况及其发酵液抗稻瘟病活性采用菌丝生长速率法测定菌株的生长情况。将OsiLf-2接种至酵母麦芽提取物液体培养基（ISP2）中，在28℃，150r/min震荡培养条件下培养10天，每天取出一定量的菌液，8000rpm离心10min取出上清液，菌体烘干至恒重并称重。上清液经0.22um无菌过滤膜过滤后按10%的比例加入PDA培养基中，混合均匀倒置平板并接种稻瘟病真菌，28℃倒置培养7天以上。检测不同培养条件对菌株生长和发酵液的抗稻瘟病活性的影响，皆采用I本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌，所述水稻内生放线菌为产水链霉菌（Streptomyces hydrogenans），保藏号为CGMCC No. 11673。
【技术特征摘要】
1.一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌，所述水稻内生放线菌为产水链霉菌（Streptomyceshydrogenans），保藏号为CGMCC...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱咏华，刘选明，曾夏冬，廖红东，刘雨晴，徐婷，袁珊珊，高艳，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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