【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物，尤其涉及肠道病毒71型vp1蛋白高保守氨基酸位点突变病毒株及其构建方法和应用。
技术介绍
1、肠道病毒(enterovirus)71型(ev71)是引起手足口病(hand,foot and mouthdisease，hfmd)的主要病原之一，其临床症状表现为手、足、口部的粘膜疱疹及溃疡，与柯萨奇病毒a16引起的hfmd类似。hfmd通常是一种自限性疾病，严重时可导致中枢神经系统感染甚至死亡。
2、ev71是一种正链rna病毒，编码一条含有2193个氨基酸的多聚蛋白，可被加工成结构蛋白和非结构蛋白，包括结构蛋白p1区(vp4、vp2、vp3、vp1)以及非结构蛋白p2区(2a、2b、2c)和p3区(3a、3b、3c、3d)。结构蛋白组装成病毒颗粒的衣壳，其中vp1蛋白暴露在病毒衣壳的表面，是主要的受体结合蛋白，该蛋白的某些位点突变已被证明可影响病毒与受体的吸附进而影响ev71的感染性和毒力。目前已经确定出5种ev71的膜受体，其中最重要的两个分别为清道夫受体b2(scarb2，广泛分布于各种组织细胞)和p选择素糖蛋白配体1(psgl-1，主要在白细胞中表达)。
3、zhang yx等人(zhang y-x,huang y-m,li q-j,li x-y,zhou y-d,guo f,et al.(2017)a highly conserved amino acid in vp1 regulates maturation ofenterovirus 71.plos pathog 13(9
技术实现思路
1、本专利技术提供肠道病毒71型vp1蛋白高保守氨基酸位点突变体、其突变病毒株及其构建方法和应用。
2、本专利技术在对肠道病毒71型vp1蛋白的定点突变筛选中发现，将vp1蛋白的以下位点进行突变：第78位由t突变为a、第88位由g突变为a、第99位由g突变为a、第133位由a突变为t、第139位由a突变为t、第158位由p突变为a、第159位由g突变为a能够显著降低病毒与受体的结合能力，显著降低病毒的增殖力和毒力，是肠道病毒71型的毒力位点。经比对，上述位点在不同基因型病毒株中高度保守，为“跨型别高保守位点(cross genotype highlyconserved sites,cghcs)”。这些突变位点及其对应蛋白突变体、突变病毒株的开发为研发新的抗ev71药物以及获得新的ev71疫苗候选株奠定了重要基础，为阐明病毒的致病机制、定位病毒的毒力决定位点提供了依据。
3、具体地，本专利技术提供以下技术方案：
4、本专利技术提供肠道病毒71型vp1蛋白突变体，所述突变体相对于肠道病毒71型野生型病毒株的vp1蛋白，含有以下突变中的一种或多种：第78位由t突变为a、第88位由g突变为a、第99位由g突变为a、第133位由a突变为t、第139位由a突变为t、第158位由p突变为a、第159位由g突变为a。
5、优选地，所述肠道病毒71型vp1蛋白突变体相对于肠道病毒71型野生型病毒株的vp1蛋白，含有以下突变中的任一种：第78位由t突变为a、第88位由g突变为a、第99位由g突变为a、第133位由a突变为t、第139位由a突变为t、第158位由p突变为a、第159位由g突变为a。
6、优选地，所述野生型病毒株为野生型病毒株hp，其vp1蛋白的氨基酸序列为将seqid no.1所示序列的第78位由a突变为t。
7、优选地，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.1-7任一所示。
8、上述vp1蛋白突变体能够使得ev71的受体结合能力下降、增殖力和毒力也明显下降。
9、本专利技术提供编码以上所述的肠道病毒71型vp1蛋白突变体的核酸分子。
10、根据上述提供的vp1蛋白突变体的氨基酸序列和密码子规则，本领域技术人员能够获得编码上述vp1蛋白突变体的核酸分子的核苷酸序列。基于密码子的简并性，该核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码上述vp1蛋白突变体的核酸分子均在本专利技术的保护范围内。
11、在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列为在肠道病毒71型野生型病毒株的vp1蛋白编码基因的基础上，进行以下突变中的任一种：第78位氨基酸的密码子突变以使得其由t突变为a、第88位氨基酸的密码子突变以使得其由g突变为a、第99位氨基酸的密码子突变以使得其由g突变为a、第133位氨基酸的密码子突变以使得其由a突变为t、第139位氨基酸的密码子突变以使得其由a突变为t、第158位氨基酸的密码子突变以使得其由p突变为a、第159位氨基酸的密码子突变以使得其由g突变为a。
12、在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.8-14任一所示。
13、本专利技术提供包含以上所述的核酸分子或表达以上所述的肠道病毒71型vp1蛋白突变体的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
14、其中，所述表达盒可为将所述核酸分子与转录和/或翻译调控元件可操作性地连接得到的重组核酸分子。
15、所述载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子等。
16、所述宿主细胞包括微生物细胞或动物细胞，所述微生物包括细菌(例如大肠杆菌)、真菌(例如酵母)或病毒(例如肠道病毒71型)。所述动物细胞可为常用于培养病毒的动物细胞(例如vero细胞等)。
17、本专利技术提供肠道病毒71型突变病毒株，所述肠道病毒71型突变病毒株包含以上所述的核酸分子或表达以上所述的肠道病毒71型vp1蛋白突变体。
18、优选地，所述肠道病毒71型突变病毒株通过将肠道病毒71型野生型病毒株的基因组进行突变以使得其vp1蛋白发生以下突变中的一种或多种得到：第78位由t突变为a、第88位由g突变为a、第99位由g突变为a、第133位由a突变为t、第139位由a突变为t、第158位由p突变为a、第159位由g突变为a。
19、在本专利技术的一些实施方式中，所述突变病毒株通过将肠道病毒71型野生型病毒株hp(zhang yx,huang ym,li qj,et al.a highly conserved amino acid in vp1regulates maturation of enterovirus 71[j].plos pathogens,2017,13(9):e1006625.doi:10.1371/journal.ppat.1006625.)的病毒基因组进行突变以使得其vp1蛋白发生以下突变中的一种或多种得到：本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.肠道病毒71型VP1蛋白突变体，其特征在于，所述突变体相对于肠道病毒71型野生型病毒株的VP1蛋白，含有以下突变中的一种或多种：第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-7任一所示。
3.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体。
4.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求3所述的核酸分子或表达权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体；
5.肠道病毒71型突变病毒株，其特征在于，所述肠道病毒71型突变病毒株包含权利要求3所述的核酸分子或表达权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体。
6.根据权利要求5所述的肠道病毒71型突变病毒株，其特征在于，所述突变病毒株通过将肠道病毒71型野生型病毒株的基因组进行突变以使
7.权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料在构建肠道病毒71型突变病毒株中的应用。
8.权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料在降低肠道病毒71型的增殖能力、毒力、受体结合能力和/或细胞吸附能力中的应用。
9.权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5或6所述的肠道病毒71型突变病毒株的以下任一种应用：
10.一种降低肠道病毒71型的增殖能力和/或毒力的方法，其特征在于，所述方法包括：将肠道病毒71型的基因组进行突变，以使得其编码VP1蛋白发生以下突变中的一种或多种：第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A。
...【技术特征摘要】
1.肠道病毒71型vp1蛋白突变体，其特征在于，所述突变体相对于肠道病毒71型野生型病毒株的vp1蛋白，含有以下突变中的一种或多种：第78位由t突变为a、第88位由g突变为a、第99位由g突变为a、第133位由a突变为t、第139位由a突变为t、第158位由p突变为a、第159位由g突变为a。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型vp1蛋白突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.1-7任一所示。
3.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的肠道病毒71型vp1蛋白突变体。
4.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求3所述的核酸分子或表达权利要求1或2所述的肠道病毒71型vp1蛋白突变体；
5.肠道病毒71型突变病毒株，其特征在于，所述肠道病毒71型突变病毒株包含权利要求3所述的核酸分子或表达权利要求1或2所述的肠道病毒71型vp1蛋白突变体。
6.根据权利要求5所述的肠道病毒71型突变病毒株，其特征在于，所述突变病毒株通过将肠道病毒71型野生型病毒株的基因组进行突变以使得其vp1蛋白发生以下突变中的一种或多种得到：第7...
【专利技术属性】
技术研发人员：岑山，张文静，张永欣，衣岽戎，李泉洁，刘茜，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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