【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及基因工程生物，特别是涉及一种改造的白介素12(以下简称nsil-12)及其基因、重组载体和在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
技术介绍
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技术介绍
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1、白介素12全称为白细胞介素12(interleukin-12，il-12)，是一种主要由抗原递呈细胞如树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和b细胞分泌的免疫调节细胞因子，由p35和p40两个亚基通过二硫键连接组成异二聚体。il-12的主要功能是参与t细胞的分化，激活t细胞和自然杀伤细胞(nk细胞)，刺激t细胞和nk细胞分泌干扰素γ，介导nk细胞和cd8+细胞毒t细胞的增强，刺激il-12受体il-12r-β1和β2的表达，参与先天免疫和继发免疫，是多功能的强免疫调节因子。
2、目前，已有许多实验室在用多种方式研究il-12的抗肿瘤作用，如：利用含il-12基因的质粒电击转化肿瘤细胞；利用生物降解微球体包裹含il-12质粒转化肿瘤细胞；利用重组il-12蛋白、抗体和il-12嵌合体、免疫细胞表达il-12、含il-12的腺病毒/逆转录病毒载体等进行基因治疗；以及il-12与化疗、放疗和免疫治疗结合进行肿瘤治疗等。上述已有研究表明这些il-12能引起人和鼠肿瘤细胞的消退或减小，以及肿瘤内血管生成减少。但是，上述各种il-12在体内的半衰期很短，需经持续注射才能够达到治疗效果，且所需il-12剂量相对较大(1～10μg/天)，而高剂量的il-12经常导致严重的全身性毒副作用。因此，急需解决il-12在体内作用半衰期短和毒副作用大的问题。
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技术实现思路
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技术实现思路
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1、为了应用il-12的抗肿瘤潜能，本文通过重新构建新的il-12，使其抗肿瘤能力保留或增强，但是毒性减弱或消除。本文通过将改造的去除n端信号肽的il-12插入新的肿瘤靶向性溶肿瘤病毒载体，构建了表达非分泌性il-12的溶肿瘤病毒，并在研究了其治疗效果和il-12的功能。基于此，本专利技术提供了一种改造的白细胞介素12(nsil-12)及其基因、重组载体和在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
2、在本专利技术的第一个方面，提供一种编码改造的白介素12的核苷酸序列，其由seqno：1所示的核苷酸序列组成。
3、所述编码改造的白介素12的核苷酸序列还可以是衍生自人白介素12核苷酸序列但不同于seq no：1的核苷酸序列，且其编码的蛋白表现出抗肿瘤效果或者可引起肿瘤消退并且与现有il-12相比具有更低的毒副作用。
4、在本专利技术的另一个方面，提供一种改造的白介素12，其由上述的核苷酸序列编码。
5、优选地，所述改造的白介素12由seq no：2所示的氨基酸序列组成。
6、所述改造的白介素12还可以由衍生自人il-12的氨基酸序列但不同于seq no：2的氨基酸序列组成，且表现出抗肿瘤效果或者可引起肿瘤消退并且与现有il-12相比具有更低的毒副作用。
7、在本专利技术的另一个方面，提供一种重组载体，其含有编码所述改造的il-12的所述核苷酸序列。
8、优选地，所述重组载体可靶向肿瘤细胞。更优选地，所述重组载体可由选自腺病毒载体、痘苗病毒载体、疱疹病毒载体的载体构建获得。
9、在一个优选例中，所述重组载体为溶肿瘤腺病毒载体ad-td-nsil-12(中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学，保藏号cctcc no：v201520，保藏日期2015年5月21日，人5型腺病毒突变株，也称为ad-td-nsil12)，其为c亚类的5型腺病毒ad5，但删除了e1a-cr2、e1b19k和e3gp19k三个基因，并利用e3gp19k启动子控制表达所述改造的il-12基因序列。
10、在本专利技术的另一个方面，提供所述的改造的il-12或者所述编码改造的白介素12的核苷酸序列或者所述载体在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
11、优选地，所述肿瘤为实体瘤、腹腔播散肿瘤或转移肿瘤。
12、编码改造的白介素12的核苷酸序列是将改造的人il-12的p35亚基编码基因(ns-p35，核苷酸序列如seq no：3所示)和改造的人il-12的p40亚基编码基因(ns-p40，核苷酸序列如seq no：4所示)通过短序列(gttcctggagtaggggtacctggggtgggc)连接获得的。
13、所述溶肿瘤腺病毒载体ad-td-nsil-12为c亚类的5型腺病毒ad5，但删除了e1a-cr2、e1b19k和e3gp19k三个基因，并利用e3gp19k启动子控制表达改造的白介素12基因序列。所述重组腺病毒载体能选择性地在肿瘤细胞中复制，并在进入肿瘤后表达改造的人il-12，改造的il-12局限在肿瘤细胞内表达；随着肿瘤细胞裂解，而表达的il-12得以释放，并同时释放肿瘤相关抗原，释放的肿瘤相关抗原与il-12协同作用，使机体产生高效、特异的抗肿瘤反应，从而进一步杀伤未被病毒感染的远处肿瘤细胞，包括转移的微小肿瘤细胞灶。这些肿瘤包括裸眼能看到或者显微镜下可见的实体瘤、转移瘤和扩散瘤。所述重组腺病毒载体对腹腔播散肿瘤和原位肿瘤具有更强的肿瘤生长抑制效果，且毒性低。
14、靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒的载体ad-td-nsil-12的构建方法，包括以下步骤：
15、(1)nsil-12融合基因克隆：提取培养的rpmi-8866细胞的总rna，逆转录为cdna，用包含snabⅰ酶切位点和弹性蛋白序列(gttcctggagtaggggtacctggggtgggc)的引物(p35-f:gttcctggagtaggggtacctggggtgggcgccagaaacctccccgtg,p35-r:gctacgtattaggaagcattcagata)进行pcr克隆人il-12的改造的p35亚基(ns-p35，核苷酸序列如seq no：3所示)和改造的p40亚基基因(引物：p40-f：cctacgtaatgatatgggaactgaagaaag，p40-r：gcccaccccaggtacccctactccaggaacactgcagggcacagatgc，ns-p40，核苷酸序列如seq no：4所示)，将ns-p40亚基基因片段与ns-p35亚基基因片段通过pcr连接成为nsil-12完整基因片段，将nsil-12完整基因片段连接进克隆载体t载体，命名为t-nsil-12；用snabⅰ酶切t-nsil-12质粒，获得nsil-12基因片段备用(seq no：1)；
16、(2)psse3gp19k穿梭载本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种改造的IL-12，其是非分泌型的。
2.根据权利要求1所述的改造的IL-12，其具有如下结构：
3.根据权利要求2所述的改造的IL-12，其中p35和p40是天然的p35和p40或其活性变体，优选地，p35和p40是天然的人p35和人p40或其活性变体；更优选地，所述p35具有或由SEQ NO：5的序列组成，p40具有或由SEQ NO：6的序列组成。
4.根据权利要求3所述的改造的IL-12，其中所述变体与其母本或天然的氨基酸序列有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99
5.根据权利要求3所述的改造的IL-12，其中所述变体包括或由在其天然的氨基酸序列或者母本序列的基础上经过取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸且保留取代、缺失、插入或添加前活性的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的改造的IL-12，其中所述的连接子具有或者由SEQNO：7的氨基酸组成。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的改造的IL-12，其具有或者由SEQ NO：2的氨基酸或其变体组成。
8.根据权利要求7所述的改造的IL-12，其中所述变体与SEQ NO：2的氨基酸序列有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上的同一性的氨基酸序列、且具有其母本或天然氨基酸序列所具有的活性。
9.根据权利要求7所述的改造的IL-12，其中所述变体包括或由在SEQ NO：2的基础上经过取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸且保留取代、缺失、插入或添加前活性的氨基酸序列组成。
10.编码权利要求1-9中任一项所述的改造的IL-12的核苷酸。
11.根据权利要求10所述的核苷酸，其包含或者由如下序列组成：
12.重组载体，其包含权利要求10或11核苷酸或者能表达权利要求1-9中任一项所述的改造的IL-12。
13.根据权利要求12所述的重组载体，其为质粒载体或者病毒载体。
14.根据权利要求12所述的重组载体，其为溶瘤病毒，优选为5型腺病毒载体、痘苗病毒载体或11型腺病毒载体，更优选为保藏号为CCTCC NO：V201520的病毒载体。
15.微生物或分离的细胞，其包含权利要求10或11核苷酸或者能表达权利要求1-9中任一项所述的改造的IL-12，其中所述分离的细胞优选为来源于人的细胞，例如来源于人肝脏、肾脏、胰腺、胃、大肠、小肠的细胞或干细胞，更优选为癌细胞或干细胞。
16.一种药物，其包括权利要求1-9中任一项所述的非分泌型IL-12、权利要求10或11的核苷酸、或权利要求12-14中任一项所述的载体。
17.治疗与IL-12相关的疾病的方法，其包括向受试者施用权利要求12-14中任一项所述的载体，优选地，所述疾病为癌症，更优选为胰腺癌、头颈部肿瘤、肺癌、食管癌、卵巢癌、大肠癌、结肠癌和胃癌，最优选为腹腔播散型肿瘤。
18.权利要求1-9中任一项所述的非分泌型IL-12、权利要求10或11的核苷酸、或权利要求12-14中任一项所述的载体在制备用于治疗受试者中与IL-12相关的疾病的药物中的用途，优选地，所述疾病为癌症，更优选为胰腺癌、头颈部肿瘤、肺癌、食管癌、卵巢癌、大肠癌、结肠...
【技术特征摘要】
1.一种改造的il-12，其是非分泌型的。
2.根据权利要求1所述的改造的il-12，其具有如下结构：
3.根据权利要求2所述的改造的il-12，其中p35和p40是天然的p35和p40或其活性变体，优选地，p35和p40是天然的人p35和人p40或其活性变体；更优选地，所述p35具有或由seq no：5的序列组成，p40具有或由seq no：6的序列组成。
4.根据权利要求3所述的改造的il-12，其中所述变体与其母本或天然的氨基酸序列有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上的同一性的氨基酸序列、且具有其母本或天然氨基酸序列所具有的活性。
5.根据权利要求3所述的改造的il-12，其中所述变体包括或由在其天然的氨基酸序列或者母本序列的基础上经过取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸且保留取代、缺失、插入或添加前活性的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的改造的il-12，其中所述的连接子具有或者由seqno：7的氨基酸组成。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的改造的il-12，其具有或者由seq no：2的氨基酸或其变体组成。
8.根据权利要求7所述的改造的il-12，其中所述变体与seq no：2的氨基酸序列有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％...
【专利技术属性】
技术研发人员：王尧河，王鹏举，尼克·莱蒙，高冬玲，
申请(专利权)人：北京锤特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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