大丽轮枝菌的致病基因、蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种大丽轮枝菌的致病蛋白，所述蛋白具有导致棉花黄萎病的作用，是如下1)或2)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；2)将SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大丽轮枝菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。还涉及编码所述蛋白的基因以及所述基因和蛋白的应用。该致病基因、蛋白与大丽轮枝菌导致棉花黄萎病的机理具有紧密联系，通过敲除该致病基因可以降低大丽轮枝菌的致病性。

Pathogenic gene and protein of Verticillium dahliae and its application

The present invention relates to Verticillium dahliae pathogenicity protein, the protein has led to cotton Verticillium wilt, 1) or 2) is as follows: 1) the protein amino acid sequence is shown as SEQ ID NO:2 protein; 2) amino acid sequence of SEQ ID NO:2 with one or several amino acid substitution and deletion and / or addition and related with Verticillium dahliae pathogenicity by 1) derived protein. The invention also relates to genes encoding the proteins and the use of the genes and proteins. The pathogenic gene and protein and the mechanism leading to Verticillium dahliae of Cotton Verticillium wilt have close contact, by knocking out the gene can reduce the pathogenicity of Verticillium dahliae.

【技术实现步骤摘要】
大丽轮枝菌的致病基因、蛋白及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及大丽轮枝菌的致病基因、蛋白及其应用。
技术介绍
由土壤丝状真菌大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)所引起的棉花黄萎病是一种土壤传播的维管束病害,病原菌变异较快，具有分布广、危害重、存活时间长、化学农药难于防治等特点，是棉花生长过程中最具毁灭性的病害之一，严重威胁着棉花的生产和发展。棉花黄萎病1914年始见于美国的费吉尼亚州，随后在其它州和世界各植棉国先后发现(沈其益，1992),1935年随引进美棉品种传入中国，但危害不重。到二十世纪50年代以后，黄萎病在我国南北局部棉区陆续发生，扩散蔓延速度加快。80年代末，黄萎病已遍及全国478个植棉县(市)。进入90年代以来，中国棉花黄萎病扩展蔓延迅猛，尤其是1993,1995,1996,2002年在全国范围内连续大发生，损失严重。据2012年第11届国际轮枝菌大会的报导，棉花2005-2010年世界平均年产量2352万吨，因轮枝菌病害造成的损失高达年产的30％，每1％产量的损失相当于损失3.54亿美元。中国是棉花生产大国，全国棉花种植面积近亿亩，棉产量占全球棉花总产量的四分之一。棉花生产的好坏不但直接影响着棉农的收入和生活，对轻纺、外贸及国防建设也有重大的影响。然而棉花黄萎病在世界范围内的盛行，严重威胁着棉花的生产和发展。在中国的棉花主要生产区新疆，每年因为黄萎病引起的棉花减产问题非常严重，给棉农及国家造成了很大的经济损失。棉花黄萎病已成为棉花生产可持续发展的主要障碍之一，被称为“棉花的癌症”(简桂良等.2003),并已成为当前制约我国棉花生产的突出问题。大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)属半知菌亚门，丛梗抱目，淡色孢科，轮枝菌属。大丽轮枝菌的寄主范围很广，涉及十字花科、蔷薇科、豆科、茄科、唇形花科、菊科等，目前已达660多种植物，并且还在逐年扩大。关于棉花黄萎病的致病机制有多种解释，其中以导管堵塞和中毒两种观点为主。60年代人们对该病菌致病机制的认识是由于菌体在导管内定殖，并大量繁殖，同时刺激邻近的薄壁细胞产生胶状物质及侵填体而堵塞导管，阻碍水分的运转，从而导致棉株萎焉(Garber,1966)。马远莉等(1990)对棉花各部位黄萎病菌在导管中的分布情况研究后认为，正常的次生木质部导管的潜在输水能力远远超过植物的总需水量，而且被堵塞的导管数占整个维管束的比例不大(最大的有17.7％)，因此导管堵塞不是导致棉花萎焉的主要原因。Keen等(1972)认为，黄萎病菌在代谢过程中产生的毒素为有毒的蛋白质，是一种酸性蛋白质一脂多糖的复合体。该复合物对感病棉花品种的叶片与根组织的细胞膜具有破坏作用，使细胞内K+和Na+大量渗漏。而抗病品种的细胞膜不具备毒素作用的受体位点而不受毒素破坏。Wang等(2004)从黄萎病原菌的菌丝中分离到一个新的具有对棉花叶片有致萎作用的蛋白VdNEP。该蛋白可以诱导烟草叶片形成坏死斑，也可以使拟南芥产生抗病反应，因此该蛋白可能参与了黄萎病菌对棉花侵染时的互作反应。但目前尚不清楚该蛋白是否与以前己分离的毒素蛋白是同一物质。现在越来越多的研究表明，黄萎病菌分泌的毒素是导致黄萎病的关键生化因子，同时组织导管的阻塞影响水分运输可能加剧了病症的产生。大丽轮枝菌是一种土传真菌，在干燥恶劣的环境下能够产生其休眠结构微菌核，从而在土壤中存活多年。所以微菌核的形成与其致病性息息相关。2004年，DobinsonKF等(Dobinson,K.F.,etal.,2004)利用改造了的EZ::TN转座系统，对来源于番茄的大丽轮枝菌的胰蛋白酶VTP1成功的进行了定向敲除。该基因能够促进微菌核的形成，但是敲除以后没有影响其致病性及生长特性。2005年，DobinsonKF等对来源于莴苣和番茄的大丽轮枝菌的细胞分裂素活化蛋白激酶基因VMK1进行了敲除。敲除VMK1后菌株对各种宿主的致病性严重衰退，说明MAP激酶介导的信号通路在真菌致病性上起着重要作用。并且基因的敲除减少了孢子的产生和微菌核的形成，说明该基因可能参与多个细胞进程。由于棉花黄萎病危害的严重性和寄主的广泛性，世界上不少国家的科技工作者对其进行了深入研究。植物在与病原物的长期协同进化过程中获得了一系列复杂的防御机制保护自己，抗性表现为组成型抗性和诱导型抗性，诱导型抗性又包括组织结构抗性和生理生化抗性。对黄萎病抗性不同的棉花品种在组织结构方面存在一定差异，己被国内外不少研究证实。抗病品种木质部的细胞间隙较小，细胞壁较厚，且木质部中含有较多的髓射线。另外，抗病品种的导管腔和木质部的纤维腔直径小于感病品种，说明棉花品种对黄萎病的抗性与其具有坚实的木质部有关。棉花的生理生化抗病性方面己有过较多的研究，研究较多的抗病相关因子包括:植保素、单宁、可溶性糖、氨基酸及多种酶类。棉株在遭受病菌侵袭后，内部产生多种抑菌物质，主要包括棉酚、植保素、单宁等，另外还与一些酶类、蛋白以及小分子物质如H202。它们的作用是非专化性，与植物的基础抗性相关。棉花抗黄萎病的机制是一个非常复杂的问题，涉及的因素众多，因此不断深入研究这些抗病反应产物在基因表达水平上的规律，对于进一步深入了解抗病机制和利用基因工程手段改造棉花品种抗性具有重要意义。抗病基因的获得是选育抗病品种的重要基础，目前通过分子生物学手段己经克隆的植物抗病基因有39个以上，其中抗病原真菌的大概有20多个，如拟南芥抗白粉病基因RPW8，番茄抗枯萎病基因泌Ve，高梁抗普通锈病(PucciniaSorghi)基因Rpl-D，且在海岛棉上已经克隆了NBS-LRR类抗病基因。在常规育种上，国内外棉花育种者一直重视抗源的筛选和创造。1983-1986年李成葆等161对911份陆地棉资源进行了抗黄萎病鉴定，筛选了抗性较好的一批抗(耐)病品种。K.V.Srinvasin鉴定了126个海岛棉品种的抗性，结果显示表现耐病和抗病的占85％。无论是通过常规方法寻找抗源，还是通过分子生物学手段克隆抗病基因都已经取得了一定的进展，但还没有找到真正防治棉花黄萎病的有效办法。根本原因在于棉花等作物遗传背景复杂，很难在分子水平进行更深入的研究，另外大丽轮枝菌小种分化变异性强等原因也为抗病遗传育种带来重重困难。因此，研究棉花黄萎病病原大丽轮枝菌与寄主植物互作的分子机理至关重要。
技术实现思路
本专利技术提供了一种大丽轮枝菌的致病基因、蛋白及其应用，该致病基因、蛋白与大丽轮枝菌导致棉花黄萎病的机理具有紧密联系，通过敲除该致病基因可以降低大丽轮枝菌的致病性。本专利技术的一个方面，提供一种大丽轮枝菌的致病蛋白，命名为HiC-15(isotrichoderminC-15hydroxylase)，来自大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)，所述蛋白具有导致棉花黄萎病的作用，是如下1)或2)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白质；2)将SEQIDNO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大丽轮枝菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。本专利技术的另一方面，提供一种大丽轮枝菌的致病基因(命名为HiC-15)，该基因编码的蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大丽轮枝菌的致病蛋白，其特征在于，所述蛋白具有导致棉花黄萎病的作用，是如下1)或2)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；2)将SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大丽轮枝菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种大丽轮枝菌的致病蛋白，其特征在于，所述蛋白具有导致棉花黄萎病的作用，是如下1)或2)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白质；2)将SEQIDNO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大丽轮枝菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。2.一种大丽轮枝菌的致病基因，其特征在于，该基因编码的蛋白具有导致棉花黄萎病的作用，是如下1)至4)中任一所述的基因：1)核苷酸序列如SEQIDNO：1中自5′末端第1-62位、第120-722位、第780-1012位和第1063-1741位所示的基因；2)核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的基因；3)在严格条件下与1)或2)限定的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；4)与1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。3.含有权利要求2所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。4.如权利要求2所述基因的用途，其特征在于，在大丽轮枝菌中敲除权利要求2所述的基因使大丽轮枝菌的致病性降低。5.一种降低大丽轮枝菌致病性的方法，其特征在于，敲除权利要求2所述的基因，具体包括如下步骤：(1)使用两对引物分别扩增SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示序列，将扩增后获得的片段导入表达载体；(2)通过步骤(1)中获得的含有SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示序列的片段的表达载体转化农杆菌；(3)选取转化成功的农杆菌；(4)通过步...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭惠珊，张涛，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11