本发明专利技术公开了具有广谱拮抗土传病原菌功能的芽孢杆菌M29产生的抗菌粗提物及其应用。该芽孢杆菌M29，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.11557，保藏日期为2015年10月29日。该菌株的发酵液离心除菌后经过酸沉淀法提取的抗菌粗提物依然均能有效拮抗灰霉、木霉、烟曲霉、黄瓜枯萎菌、棉花枯萎菌、甜瓜枯萎菌、草莓根腐菌、桃溃疡菌、大丽轮枝菌、水稻纹枯菌等病原真菌；具有易保存，可大量生产，防效好，环境安全性好等优点，具有良好的商业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种微生物，具体地说涉及具有广谱拮抗土传病原菌功能的芽孢杆菌M29产生的抗菌粗提物及其应用。
技术介绍
植物病害的生物防治是指通过除人以外的一种或多种生物来降低病原物数量或减弱病原的致病活力，从而减少病原物所致病害的发生。蚯蚓粪中具有丰富的有益微生物，能够有效拮抗土传病原真菌。据报道拮抗微生物可通过与病原菌的抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生系统抗性等机理来抑制病原菌，达到防治植物病害的目的。此外，拮抗微生物对环境安全，不会像化学农药那样造成环境污染以及对人畜的毒害，同时拮抗微生物不易使病原菌产生耐药性，有些还具有促进植物生长的作用，且实际生产工艺简单，因此利用拮抗微生物防治病害的研究正越来越受到国内外科研机构的重视。目前，人们已经分离到多种对各种不同植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物，其中有些己经进入实际应用阶段，产生了相当的社会效益和环境效益。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供具有广谱拮抗土传病原菌功能的芽孢杆菌M29的产生的抗菌粗提物。本专利技术的另一目的是提供该芽孢杆菌产生的抗菌粗提物的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现:—株具有广谱拮抗土传病原菌功能的芽孢杆菌M29，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.11557，保藏日期为2015年10月29日。所述芽孢杆菌M29菌落在LB平板上，培养初期菌落饱满透明，积累大量粘液，牢固地附着在培养基上，培养后期呈裂叶状，边缘毛发状，培养3d后菌落呈褶皱皇起的山丘状。可产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大，细胞形态和排列呈杆状，单生，无荚膜，可运动。所述芽孢杆菌M29的生理生化特性是:革兰氏阳性，严格好氧，化能异养，M.R试验阴性，VP实验阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阴性，柠檬酸盐利用阳性，硝酸盐还原阳性。本专利技术所述的芽孢杆菌M29培养时使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、尿素、丙氨酸;使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、木糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖;使用的无机组分包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。本专利技术的芽孢杆菌M29发酵可在25?37°C，pH4?10，氯化钠浓度在1 %~10%的环境下进行。本专利技术所述的芽孢杆菌M29产生的抗菌粗提物，通过以下方法制备得到:将本专利技术所述的芽孢杆菌M29进行发酵，发酵液离心，所得上清液用灭过菌的0.22μπι孔滤膜过滤除菌，经平板培养无菌落形成视为无菌滤液；培养结束后，离心取上清液，在上清液中加入6mol.L HCL调节pH至2.0，4°C过夜，离心，收集沉淀，用pH2.0的水洗数次，沉淀干燥后加入甲醇抽提2次，合并抽提液，旋转蒸发，得到淡黄色粉末，溶于pH6.8的磷酸缓冲液中，然后用0.22μπι的滤膜过滤后即得抗菌粗提物。本专利技术所述的抗菌粗提物在制备拮抗灰霉、木霉、烟曲霉、黄瓜枯萎菌、棉花枯萎菌、甜瓜枯萎菌、草莓根腐菌、桃溃疡菌、大丽轮枝菌和/或水稻纹枯菌的生防制剂中的应用。有益效果:本专利技术提供了一株对能够有效拮抗灰霉、木霉、烟曲霉、黄瓜枯萎菌、棉花枯萎菌、甜瓜枯萎菌、草莓根腐菌、桃溃疡菌、大丽轮枝菌、水稻纹枯菌等多种病原菌，同时，该菌株的发酵液离心除菌后经过酸沉淀法提取的抗菌粗提物依然均能有效拮抗灰霉、木霉、烟曲霉、黄瓜枯萎菌、棉花枯萎菌、甜瓜枯萎菌、草莓根腐菌、桃溃疡菌、大丽轮枝菌、水稻纹枯菌等病原真菌;具有易保存，可大量生产，防效好，环境安全性好等优点，具有良好的商业应用前景。【附图说明】图1 Μ29在显微镜目镜10Χ，油镜100Χ下的形态图2Μ29菌株对灰霉的拮抗效果。图3Μ29菌株对黄瓜枯萎的拮抗效果。图4Μ29菌株对草莓根腐的拮抗效果。图5Μ29菌株对棉花枯萎的拮抗效果。图6Μ29菌株对桃溃疡的拮抗效果。图7Μ29菌株对大丽轮枝的拮抗效果。图8Μ29菌株对木霉的拮抗效果。图9Μ29菌株对甜瓜枯萎的拮抗效果。图10Μ29菌株对烟曲霉的拮抗效果。图11Μ29菌株对水稻纹枯的拮抗效果。图12Μ29菌株产抗菌物质对灰霉的拮抗效果。图13Μ29菌株产抗菌物质对黄瓜枯萎的拮抗效果。图14Μ29菌株产抗菌物质对草莓根腐的拮抗效果。图15Μ29菌株产抗菌物质对棉花枯萎的拮抗效果。图16Μ29菌株产抗菌物质对桃溃疡的拮抗效果。图17Μ29菌株产抗菌物质对大丽轮枝的拮抗效果。图18Μ29菌株产抗菌物质对木霉的拮抗效果。图19Μ29菌株产抗菌物质对甜瓜枯萎的拮抗效果。图20Μ29菌株产抗菌物质对烟曲霉的拮抗效果。图21Μ29菌株产抗菌物质对水稻纹枯的拮抗效果。生物材料保藏信息Μ29，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.11557，保藏日期为2015年10月29日。【具体实施方式】实施例1首先准备以下三种培养基。LB固体培养基:蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂30g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2，121°C 灭菌，20min。LB液体培养基:不加琼脂，其它条件同上。 PDA培养基:葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，马铃薯粉6.0g，蒸馏水1000ml，pH5.4-5.8,115°C灭菌，30mine。YTO培养基:葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，琼脂30g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.2,115°C 灭菌，30mine。将蚯蚓粪称取10g置于盛有100ml灭菌水的250ml的三角瓶中，在摇床中，30°C，150r.min—1振荡20min，静置lOmin，得到悬浮液。该悬浮液中含有若干种菌，采用梯度稀释法稀释后涂于LB培养基，将平板倒置，于30°C，恒温箱中培养24h后，挑取不同类型典型单个菌落，经平板纯化后，4°C保存在LB斜面待用。下面再通过平板对峙实验验证该菌的拮抗作用。初筛:分别将木霉，灰霉，烟曲霉，大丽轮枝菌，棉花枯萎菌，甜瓜枯萎菌，桃溃疡菌，草霉根腐菌用打孔器打孔后转接于PDA平板中央，黄瓜枯萎菌，水稻纹枯菌用打孔器打孔后转接于Yro培养基中央，然后将分离纯化后的细菌挑取单菌落点接在真菌的四角，置于30°C培养箱培养，灰霉置于25°C培养箱，培养3-5d，根据抑菌效果选出效果好的细菌。复筛:将初筛得到的效果好的细菌按照上述实验方法重复，筛选出了一株对十种真菌病原菌均有拮抗作用且效果明显的菌株，命名为M29(图2?图11)。如图1所示，该菌株在油镜100X，目镜10X的显微镜条件下的形态特征。将上述方法筛选分离出的菌株，经南京思普金专业测序公司测序，根据16SrDNA的测序结果，在http: //www.ncb1.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16S rDNA序列进行同源性比较，确定其为芽孢杆菌，然后通过B1log结果以及生理生化特征确定为枯草芽孢杆菌。将该菌株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.11557本文档来自技高网...
【技术保护点】
芽孢杆菌M29产生的抗菌粗提物，其特征在于所述的芽孢杆菌M29，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.11557，保藏日期为2015年10月29日；所述的抗菌粗提物通过以下方法制备得到：将所述的芽孢杆菌M29进行发酵，发酵液离心，所得上清液用灭过菌的0.22μm孔滤膜过滤除菌，经平板培养无菌落形成视为无菌滤液；培养结束后，离心取上清液，在上清液中加入6mRl·L HCL调节pH至2.0，4℃过夜，离心，收集沉淀，用pH2.0的水洗数次，沉淀干燥后加入甲醇抽提2次，合并抽提液，旋转蒸发，得到淡黄色粉末，溶于pH6.8的磷酸缓冲液中，然后用0.22μm的滤膜过滤后即得抗菌粗提物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李辉信，穆静娟，焦加国，胡锋，葛新成，李根，虞丽，金辰，武俊，刘春亮，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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