本发明专利技术公开了与抗真菌危害有关的磷脂酶靶基因片段及其在提高植物抗病性中的应用，属于大丽轮枝菌病程关键基因的克隆及应用领域。本发明专利技术通过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)将大丽轮枝菌磷脂酶靶基因的靶基因序列导入本生烟中瞬时表达dsRNA，筛选到能极显著提高植物抗病性的靶基因。本发明专利技术进一步利用RNAi技术，构建稳定遗传干扰载体并将其转化本生烟，转化结果证明转基因烟草植株对大丽轮枝菌的抗病性极显著提高，表现出高抗，甚至达到免疫等级。本发明专利技术提供的抗真菌危害有关的磷脂酶靶基因片段以及所转录的RNA在提高植物对大丽轮枝菌的抗病能力以及培育抗大丽轮枝菌转基因植物新品种等方面应用前景广泛。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及抗真菌危害有关的憐脂酶祀基因，尤其设及大丽轮枝菌憐脂酶祀基因 片段W及该憐脂酶祀基因片段所转录的RNA，本专利技术还设及含有所述憐脂酶祀基因片段的 RNA干扰载体，本专利技术进一步设及所述大丽轮枝菌憐脂酶祀基因片段或含有该憐脂酶祀基 因片段的RNA干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌抗病性中的应用，属于大丽轮枝菌病程关 键基因的克隆及应用领域。
技术介绍
大丽轮枝菌（Verticilliumd址liae)是一种危害极其严重±传维管束真菌 病害，寄主范围非常广泛，能侵染棉花、向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、马铃馨、甜瓜、西 瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等两百多种经济作物，给中国乃至世界造成 极大的经济损失(HillocksIR.Cottondiseases.CentreAgricultureBioscience International, 1992:240~257.)，而且其后期产生的微菌核可W在极其恶劣的环 境下存活数年甚至更长的时间（KlostermanSJ,Atall址ZK,ValladGE,Subbarao KV:Diversity,pathogenicity,andmanagementofVerticilliumspecies.AnnRev Phytopathol2009, 47:39 - 62.)，主要存在于±壤耕作层，是大丽轮枝菌在±壤中的主要 存活结构和初侵染源，用药剂难于防治，成为农业物生产发展的瓶颈（化adinEF，Thomma BP:PhysiologyandmolecularaspectsofVerticilliumwiltdiseasescausedby V.d址liaeandV.a化o-atrum.MolPlantPathol2006, 7:71 - 86.)。鉴于其严重的危 害性，探究大丽轮枝菌致病机理和寄主与病原菌之间的相互作用机制一直是研究的热点 (LuoX,XieC,DongJ,YangX,SuiA.InteractionsbetweenVerticilliumdahliaeand itshost:vegetativegrowth,pathogenicity,plantimmunity.Appliedmicrobiology andbiotechnology2014,98:6921-6932.)。如何增强寄主植物体对大丽轮枝菌的抗病 性是急待解决的问题。然而大丽轮枝菌致病机理的研究仍停留在初步探索阶段。最近 研究表明：大丽轮枝菌入侵过程中分泌蛋白主要参与寄主植物细胞壁降解、活性氧应答， 还包括一些效应因子、新陈代谢蛋白因子等，或许运些分泌蛋白参与了大丽轮枝菌的渗 透侵染寄主植物的根部，达到入侵的目的（HogenhoutSA,VanderHoornRA,Terauchi R,KamounS.Emergingconceptsineffectorbiologyofplant-associatedorganisms. Molecularplant-microbeinteractions2009, 22:115-122.ChuJ,LiWF,ChengW,Lu M,ZhouKH,ZhuHQ,LiFG,ZhouCZ.Comparativeanalysesofsecretedproteins fromthephytopathogenicfungusVerticilliumdahliaeinresponsetonitrogen starvation.BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-ProteinsandProteomics 2015, 1854:437-448.)。 大丽轮枝菌如何渗透到寄主细胞和如何阻碍寄主细胞的防卫机制至今还没有文 献报道。探索大丽轮枝渗透寄主细胞机制，寻找参与渗透过程中关键的蛋白因子或是信号 诱导因子的研究显得尤其重要，并利用"反向遗传学"培育抗病的新材料品种提供了一条新 的策略。 麟脂是真菌生物膜的主要组成成分，在生物体的新陈代谢中发挥着不可替代 的作用。麟脂酶（phospholipase,PL)广泛存在于真菌生物体内，是水解麟脂的一类 酶，因其水解的醋键不同，分为麟脂酶AUPLA1)、麟脂酶A2巧LA2)、麟脂酶B巧LB)、麟脂 酶C巧LC)和麟脂酶D巧LD)。麟脂酶AUPLJU)、麟脂酶A2巧LA2)和麟脂酶B巧1的是乙 醜水解酶，麟脂酶C巧LC)和麟脂酶IKPLD)为麟酸二醋酶，水解麟酸二醋键Whannoum Μ.Potentialroleofphospholipasesinvirulenceandfungalpathogenesis. Clinicalmicrobiologyreviews2000, 13:122 - 143.)D5葬脂酶的激活不仅对细胞的结 构和稳定性有很重要的作用，而且调控许多重要的细胞生理功能，如信号转导、细胞骨架组 装、防御反应等（HuangP,FrohmanΜΑ.ThepotentialforphospholipaseDasanew therapeutictarget.ExpertOpiniononTherapeuticTargets2007,11:707 - 716. CoxGM，McDadeHC，QienSC，GottfredssonM，Wri組tLC，SorrellTC，Leidich SD,CasadevallA,PerfectJ民.Extracellularphospholipaseactivityisavirulence factorforCryptococcusneoformans.MolecularMicrobiology2001，39:166 - 175. JonesJDG，DanglJLHieplantimmunesystem.Nature2006, 444:323 - 329.Pinosa F,BuhotN,KwaaitaalM,Fah化ergP,Thordal-ChristensenH,巨llerstTOniM,Andersson MX.ArabidopsisphospholipaseDδisinvolvedinbasaldefenseandnonhost resistancetopowdeiTmildewfungi.Plantphysiology2013,163:896-906·)。研究 发现，真菌的麟酸二醋酶在真菌细胞壁的完整性途经中发挥着重要作用，是调控细胞壁合 成的重要蛋白因子（YinZY，TangW，WangJZ，LiuXY，YangLN，GaoCY，ZhangJLZhang HF,ZhengXB,WangP,ZhangZG.PhosphodiesteraseMoPdeHtargetsMoMcklofthe conservedMAPkinasesignalingpathwaytoregulatecellwallintegrityin riceblastfungusMagnaportheoryzae.MolecularPlantPathology，2015.Lesage GandBussey比Cellwallassemb本文档来自技高网...
【技术保护点】
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)磷脂酶靶基因片段，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示；优选的，其核苷酸序列为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示；更优选的，其核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程红梅，齐希梁，苏晓峰，郭惠明，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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