本申请提供了蜡样芽胞杆菌的野生型磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C的突变体，涉及的突变包括第63位的天冬酰胺突变为其他氨基酸，还可以包括第20位的精氨酸至组氨酸以及第83位的丙氨酸至天冬氨酸的突变。本申请还提供了编码所述突变体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的细胞。本申请还提供了所述突变体、核酸分子载体以及细胞的用途。
【技术实现步骤摘要】
磷脂酶C突变体及其用途专利
本申请涉及磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C突变体及其用途。专利技术背景脱胶是油脂精炼的重要步骤，传统的水化脱胶法经济成本高，物料能耗大，环境污染重，所以近些年来，很多工作致力于将酶法脱胶用于油脂精炼中的脱胶环节。同传统方法相比，酶法脱胶能够提高经济效益，实现节能减排，对生态环境污染少，在环保、经济、质量等方面具有较大的优势。油脂脱胶中所用的一种酶为磷脂酶。同其他脱胶酶相比，磷脂酶C(PLC)表现出更大的优势，例如，增加甘二酯(DAG)的得率，以及减少得油量的损失。蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(BC-PC-PLC)是研究较早的一种磷脂酶C。BC-PC-PLC全长为283个氨基酸，其中包含24个氨基酸的信号肽和14个氨基酸的前导肽，成熟肽为245个氨基酸(参见，例如Johansen,T.,Holm,T.,Guddal,P.H.,Sletten,K.,Haugli,F.B.,Little,C.(1988)."Cloningandsequencingofthegeneencodingthephosphatidylcholine-preferringphospholipaseCofBacilluscereus."Gene65(2):293-304)。BC-PC-PLC的晶体结构已有报道，其由多个螺旋结构域组成，催化位点为55位天冬氨酸，并且含有至少三个Zn2+结合位点(参见，例如Hough.,E.,Hansen,L.K.,Birknes,B.,Jynge,K.,Hansen,S.,Hordvik,A.,Little,C.,Dodson,E.,Derewenda,Z.(1989)"High-resolution(1.5A)crystalstructureofphospholipaseCfromBacilluscereus."Nature.338:357-60)。BC-PC-PLC的异源表达研究较少，已有报道涉及在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和毕赤酵母(pichiapastoris)中表达BC-PC-PLC(参见，例如Durban,M.A.,Silbersack,J.,Schweder,T.,Schauer,F.,Bornscheuer,U.T.(2007)HighlevelexpressionofarecombinantphospholipaseCfromBacilluscereusinBacillussubtilis.ApplMicrobiolBiotechnol74(3):634-639;以及Seo,K.H,RheeJ.I.(2004)High-levelexpressionofrecombinantphospholipaseCfromBacilluscereusinPichiapastorisanditscharacterization.BiotechnolLett26(19):1475-1479)。本领域中需要改进的(例如酶活性更高的)磷脂酶C。专利技术概述第一方面，本申请提供了具有磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C活性的多肽，所述多肽包含突变的SEQIDNo:2所示的氨基酸序列或其活性片段，其中所述突变包括将SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第63位的天冬酰胺进行突变。在一些实施方案中，将SEQIDNo:2的氨基酸序列的第63位的天冬酰胺突变为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)。在一些实施方案中，将SEQIDNo:2的氨基酸序列的第63位的天冬酰胺突变为丝氨酸(S)。在一些实施方案中，所述突变还包括SEQIDNo:2氨基酸序列的第20位的精氨酸被组氨酸取代以及第83位的丙氨酸被天冬氨酸取代。在一些实施方案中，所述多肽的氨基酸序列包含选自SEQIDNo:8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40、42、44、46或48的氨基酸序列或由选自SEQIDNo:8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40、42、44、46或48的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述多肽的氨基酸序列包含SEQIDNo:12所示的氨基酸序列或由SEQIDNo:12所示的氨基酸序列组成。第二方面，本申请提供了编码第一方面中所述的多肽的核酸分子。本申请还提供了核酸分子，其包含选自SEQIDNo:7、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41、43、45或47的核酸序列。本申请还提供了核酸分子，其包含SEQIDNo:11所示的核酸序列。第三方面，本申请提供了包含第二方面所述的核酸分子的载体。在一些实施方案中，所述载体为表达载体。在一些实施方案中，所述载体被设计用于真核细胞或原核细胞中表达。在一些实施方案中，所述载体被设计用于细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞中表达。第四方面，本申请提供了包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞为真核细胞或原核细胞。在一些实施方案中，所述细胞为细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。第五方面，本申请提供了第四方面所述的细胞产生的磷脂酶C。第六方面，本申请提供了第一方面所述的多肽、或第二方面所述的核酸分子编码的多肽、或第三方面所述的载体编码的多肽、或第四方面所述的细胞表达出的多肽、或第五方面所述的磷脂酶C作为磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C的用途。在一些实施方案中，所述用途为在油脂脱胶工艺中的用途。第七方面，本申请提供了第一方面所述的多肽、或第二方面所述的核酸分子、或第三方面所述的载体、或第四方面所述的细胞在制备脱胶酶中的用途。附图简要说明图1为实施例1中获得的野生型BC-PC-PLC毕赤酵母表达菌株G15和1-3的MM-卵黄筛选平板的结果图，上方4个克隆为G15，下方6个克隆为1-3，其中菌株在30℃下培养三天。白色沉淀圈的正下方标出了对应的菌株的名称。图2为实施例2中获得的突变株7-3-3的MM-卵黄筛选平板的结果图，其中菌株在30℃下培养2天。白色沉淀圈的正下方标出了对应的菌株的名称。图3为实施例4中获得的BC-PC-PLC点突变毕赤酵母表达菌株PLC-R20H的MM-卵黄筛选平板的结果图，其中菌株在30℃下培养3天。白色沉淀圈的正下方标出了对应的菌株的名称图4为实施例4中获得的BC-PC-PLC点突变毕赤酵母表达菌株PLC-N63S的MM-卵黄筛选平板的结果图，其中菌株在30℃下培养3天。白色沉淀圈的正下方标出了对应的菌株的名称。图5为实施例4中获得的BC-PC-PLC点突变毕赤酵母表达菌株PLC-A83D的MM-卵黄筛选平板的结果图，其中菌株在30℃下培养3天。白色沉淀圈的正下方标出了对应的菌株的名称。图6为实施例4中获得的BC-PC-PLC点突变毕赤酵母表达菌株PLC-R20HN63SA83D的M本文档来自技高网...
【技术保护点】
具有磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C活性的多肽，所述多肽包含突变的SEQ ID No:2所示的氨基酸序列或其活性片段，其中所述突变包括将SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的第63位的天冬酰胺进行突变。
【技术特征摘要】
1.具有磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C活性的多肽，所述多肽由突变的SEQIDNo:2所示的氨基酸序列组成，其中所述突变为将SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第63位的天冬酰胺突变为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)。2.如权利要求1所述的多肽，所述多肽的氨基酸序列由选自SEQIDNo:8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40、42、44、46或48的氨基酸序列组成。3.具有磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C活性的多肽，所述多肽由突变的SEQIDNo:2所示的氨基酸序列组成，其中所述突变为：将SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第63位的天冬酰胺突变为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)；将SEQIDNo:2氨基酸序列的第20位的精氨酸突变为组氨酸；以及将SEQIDNo:2氨基酸序列的第83位的丙氨酸突变为天冬氨酸。4.如权利要求3所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列由SEQIDNo:12所示的氨基酸序列组成。5.编码权利要求1-4中任一项所述的多肽的核酸分子。6.如权利要求5所述的核酸分子，其由选自SEQIDNo:7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41、43、45或47的核酸序列组成。7.包含权利要求5或6所述的核酸分子的载体。8.如权利要求7所述的载体，其中所述载体为表达载体。9.如权利要求8所述的载体，其中所述载体被设计用于真核细胞或原核细胞中表达。10.如权利要求9所述的载体，其中所述载体被设计用于细菌细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞中表达。11.如权利要求9所述的载体，其中所述载体被设计用于酵母细胞中表达。12.包含权利要求5或6所述的核酸分子或权利要求7-11中任...
【专利技术属性】
技术研发人员：许骏，宣姚吉，李金敏，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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