一种新型的植酸酶制造技术

本发明专利技术目的是提供一种新型的植酸酶，即在植酸酶UNK的基础上通过大量的突变筛选，最终获得一种耐热性得到显著提高的植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。本发明专利技术以植酸酶UNK为基础，提供了包含T161P单点突变的新型植酸酶UNK1，包含T161P、D185N和N204C三点突变的植酸酶突变体UNK3和包含T161P、D185N、S189N、N204C和S240P五点突变的植酸酶突变体UNK5。与植酸酶UNK相比，UNK1、UNK3和UNK5的最适作用温度和最适作用pH没有发生改变，最适作用温度均为75℃，最适作用pH均为5.0，但其耐热性得到显著提升。

【技术实现步骤摘要】
一种新型的植酸酶
本专利技术属于酶基因改造
，具体涉及一种新型的植酸酶。 技术背景 植酸酶（Phytase)即肌醇六磷酸水解酶（EC3. 1. 3. 8)，是催化植酸以及植酸盐水 解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。植酸酶作为一种优良的饲料添加剂目前被 广泛地应用于畜牧业生产中，它能够提高动物对磷元素的利用率，以及蛋白质、氨基酸、各 种矿物元素的利用率，解除动物植物性饲料中植酸的抗营养作用，提高植物性饲料的营养 价值，同时降低动物排泄物对环境的污染，在动物生产以及在环境保护中，是极为有效的一 种添加剂，具有重要的应用价值。另外，农业部、环保部联合印发的《全国畜禽养殖污染防 治十二五规划》中指出，将重点治理畜禽养殖污染，这也给植酸酶应用提供了更有利的机 遇。 现工业化生产的植酸酶主要有来源于黑曲霉的真菌植酸酶和来源于大肠杆菌的 细菌植酸酶两种。其中来源于大肠杆菌的植酸酶APPA具有高比活性及良好的消化道稳定 性等特点。目前主要通过在粉末饲料直接添加或颗粒饲料后喷涂的方法应用在饲料行业。 细菌植酸酶APPA热稳定性较差，使APPA植酸酶在颗粒饲料的应用受到限制。采用饲料制 粒后植酸酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且对酶制剂的稳定性、饲料中 分布均一性都无法很好的保证。因此，提高植酸酶的热稳定性对目前饲用植酸酶具有重要 意义。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种新型的植酸酶及其应用，即在植酸酶UNK 的基础上通过大量的突变筛选，最终获得一种耐热性得到显著提高的植酸酶，为其在饲料 领域的广泛使用奠定了基础。 本专利技术一方面提供了一种新型的植酸酶，是氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的植酸酶 的第161位氨基酸由Thr变为Pro。 上述新型植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID N0:3,其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID N0:4。 本专利技术还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:4的植酸酶基因的质粒。 本专利技术还提供另一种新型的植酸酶，是氨基酸序列为SEQ ID NO:3的植酸酶的第 185位氨基酸由Asp变为Asn，第204位氨基酸由Asn变为Cys。 上述植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5,其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID N0:6。 本专利技术还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:6的植酸酶基因的质粒。 本专利技术再提供提供一种植酸酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:5的植酸酶的 第189位氨基酸由Ser变为Asn,第240位氨基酸由Ser变为Pro。 上述植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:7,其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID N0:8。 本专利技术还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:8的植酸酶基因的质粒。 本专利技术还提供了 一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。 所述宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris)。 本专利技术以植酸酶UNK为基础，提供了包含T161P单点突变的新型植酸酶UNK1，包含 T161P、D185N和N204C三点突变的植酸酶突变体UNK3和包含T161P、D185N、S189N、N204C 和S240P五点突变的植酸酶突变体UNK5。与植酸酶UNK相比，UNK1、UNK3和UNK5的最适 作用温度和最适作用PH没有发生改变，最适作用温度均为75°C，最适作用pH均为5. 0,但 其耐热性得到显著提升，80°C处理5min后，植酸酶UNK的残留酶活低于25%，而其突变体 UNK1、UNK3和UNK5的残留酶活比植酸酶UNK分别提高了 10. 00%、24. 06%和39. 75%，从 而有利于其在饲料中的广泛应用。 【附图说明】 图1为重组质粒图谱； 图2为植酸酶UNK及其突变体UNKl、UNK3和UNK5耐热性比较图。 【具体实施方式】 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》 (第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。 所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，而不仅限于具体实施例的记 载。 实验材料和试剂： 菌株与载体：大肠杆菌DH5a、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自 Invitrogen 公司。 酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas 公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂 盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。 培养基配方： 大肠杆菌培养基（LB培养基）：0· 5%酵母提取物，1%蛋白胨，1% NaCL, ρΗ7· 0); LB-AMP培养基：LB培养基加 100 μ g/mL氨苄青霉素； 酵母培养基（YH)培养基）：1 %酵母提取物、2 %蛋白胨2 %葡萄糖； 酵母筛选培养基（MD培养基）：2 %蛋白胨、2 %琼脂糖； BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，IOOmM磷酸钾缓冲液（pH6. 0),1.34% YNB，4X 10-5生物素，1 %甘油； BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，IOOmM磷酸钾缓冲液（pH6. 0),1.34% YNB，4X10-5 生物素，0. 5% 甲醇。 下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。 实施例1 :大肠杆菌植酸酶突变体基因的合成与重组质粒的获得 以核苷酸序列为SEQ ID NO :2所示植酸酶（命名为UNK)的基因序列为参考，在上 海捷瑞生物工程有限公司人工合成该基因，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO :1。 根据植酸酶UNK基因的Y端设计PCR引物含有EcoRI内切酶位点，3 ^端设计PCR 引物含NotI内切酶位点，引物序列如下： 5 ' 端引物 UNK-F : CGCGAATTCCAGTCAGAACCAGAGTTGAAGTT ; 3 ' 端引物：UNK-R : CGCGAATTCCAGTCAGAACCAGAGTTGAAGTT ; 以合成的植酸酶基因 UNK为模板，用上述引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：模 板 I. 0 μ L,上游引物UNK-F I. 0 μ L,下游引物UNK-F I. 0 μ L, 5XPS BufferlO. 0 μ L, dNTPs (2. 5mM) 4· 0 μ L, Primer-StarDNA 聚合酶 I. 0 μ L，ddH20 32. 0 μ L，反应总体系为 50 μ L。PCR 循环程序为：94°C预变性 4min，30cycles:94°C 30sec，55°C 40sec，72°C 2min，72°C IOmin ; 胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pPIC-9k载体16°C过夜连 接并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR(反 应体系：模板挑取的单克隆，rTaqDNA 聚合酶 0· 5ul，10XBuffer2.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型的植酸酶，其特征在于，所述的植酸酶是氨基酸序列为SEQ IDNO:1的植酸酶的第161位氨基酸由Thr变为Pro。

【技术特征摘要】
1. 一种新型的植酸酶，其特征在于，所述的植酸酶是氨基酸序列为SEQ IDN0:1的植酸 酶的第161位氨基酸由Thr变为Pro。2. 如权利要求1所述的植酸酶，其特征在于，所述的植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID N0:3。3. -种基因，其特征在于，所述的基因用于编码权利要求1所述的植酸酶。4. 如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQ IDN0:4。5. -种植酸酶，其特征在于，所述的植酸酶是权利要求1所述的植酸酶的第185位氨基 酸由Asp变为Asn，第204位氨基酸由Asn变为Cys ;其氨基酸序列为SEQ ID N0:5。6. 编码权利要求5所述的植酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴秀秀，王坤，王华明，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37