本发明专利技术提供一种高效表达植酸酶的工程菌株构建，涉及生物技术领域，具体涉及一种高效表达适应范围更广的大肠杆菌植酸酶诱变工程菌株。将重组表达质粒pET30a（+）-appA转化入大肠杆菌表达宿主中，获得重组表达工程菌株W，再通过乳糖诱变获得新的大肠杆菌植酸酶重组表达工程菌株M6。M6工程菌株与W工程菌株相比，未发生基因突变，但其植酸酶酶活更高，摇瓶培养酶活达到807.35U/mL。且与W工程菌株相比，M6工程菌株表达的植酸酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐性分别提高了17.44%和34.77%。本发明专利技术的M6工程菌株能高效表达适应范围更广的植酸酶，这种诱变植酸酶可作为一种饲料添加剂，能在动物消化道内更好的消化利用植酸盐，减少有机磷的排放，促进畜禽业的生态养殖。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种高效表达植酸酶的工程菌株构建，涉及生物
，具体涉及一种高效表达适应范围更广的大肠杆菌植酸酶诱变工程菌株。将重组表达质粒pET30a（+）-appA转化入大肠杆菌表达宿主中，获得重组表达工程菌株W，再通过乳糖诱变获得新的大肠杆菌植酸酶重组表达工程菌株M6。M6工程菌株与W工程菌株相比，未发生基因突变，但其植酸酶酶活更高，摇瓶培养酶活达到807.35U/mL。且与W工程菌株相比，M6工程菌株表达的植酸酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐性分别提高了17.44%和34.77%。本专利技术的M6工程菌株能高效表达适应范围更广的植酸酶，这种诱变植酸酶可作为一种饲料添加剂，能在动物消化道内更好的消化利用植酸盐，减少有机磷的排放，促进畜禽业的生态养殖。【专利说明】一种高效表达植酸酶的工程菌株构建
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高效表达适应范围更广的大肠杆菌植酸酶诱变工程菌株，本专利技术还涉及该诱变工程菌株的生产及应用。
技术介绍
磷是动物生长必要的元素，存在于动物体所有细胞中，几乎参与所有生理上的化学反应。其含量超过动物机体矿物质总量的1/4,在动物体内以磷酸盐形式存在,其中80% 以羟磷存在于骨骼和牙齿中，另外20%则存在于肌肉、血液及软骨中。长期磷缺乏会导致动物生长组织受到抑制，骨骼变软变脆，诱发生长动物的佝偻病和成年动物的骨质疏松症，从而影响动物的生长性能。为满足动物对磷的需求，目前大多在动物饲料中添加无机磷，如磷酸氢钙。而以植物性饲料为主的动物日粮中本身就含有丰富的磷源，但它们主要以动物不能直接吸收的植酸或植酸盐形式存在。植酸及植酸盐是植物性饲料(如谷物、豆类和油料等作物籽实)中的磷和肌醇基本贮存形式，其含量达到1飞％，占植物中总磷的6(T80%。但是，由于单胃动物(如猪、鸡等)的消化道和鱼类的小肠缺乏有效消化植酸磷的酶类(MaenzDD, Classen HL.Phytase activity in the small intestinal brush border membrane of the chicken.Poult Sci，1998，77 (4):557_563)，植酸磷没有经过充分消化吸收就直接排出体外，给畜禽养殖业带来许多问题:第一、造成磷源浪费，一方面饲料中的磷源不能得到有效利用，研究表明: Ig的植酸完全分解可释放281.6mg的无机磷，是非常丰富的无机磷源；另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在饲料中额外添加无机磷，伴随国际磷价格的攀升，饲料成本不断提高；同时，由于生产工艺问题，添加的无机磷中氟、重金属等元素含量超标，易造成动物中毒。第二、形成高磷粪便而污染环境，植物性饲料中85%的植酸磷未被消化就随粪便排出， 使大量的磷进入水和土壤中造成环境富营养化，严重破坏了养殖生态环境。第三、植酸还是一种抗营养因子，具有与EDTA相似的强螯合能力，在动物肠胃道的消化吸收过程中会与多种金属离子(Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、CU2+、Mn2+等)以及带正电的蛋白质和维生素螯合成相应的不溶性复合物，从而降低了动物对这些营养元素的有效利用。植酸酶(phyt ase)是一种能催化植酸及其盐水解为磷酸(或磷酸盐)和肌醇的酶类统称(黄遵锡.植酸酶基础及应用研究状况.食品与发酵工业，1999，25 (2):54-58)， 它实际包含了植酸酶和酸性磷酸酶两种酶。根据植酸酶对底物的作用方式可以分成三类:3_植酸酶(EC.3.1.3.8)、6_植酸酶(EC.3.1.3.26)和非特征的正磷酸单酯磷酸水解酶 (EC.3.1.3.2)。真菌(酵母、曲霉等)和大多数细菌(包括枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌等)来源的植酸酶属于3-植酸酶，这类酶发挥作用需要Mg2+的辅助，而植物和大肠杆菌来源的植酸酶属于6-植酸酶。研究发现，来源于大肠杆菌的植酸酶(植酸酶APPA)是迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶，具有一下几个特点:第一、同时具有植酸酶和磷酸酶功能，最适pH分别为4.5和2.5~3.0 ;第二、最适反应温度为55飞(TC，在37°C时，也可以发挥 50%左右的酶活性；第三、具有良好的蛋白酶抗性，在pH为2.5的胃蛋白酶中处理2小时，保存80%的酶活，在pH为7.0的胰蛋白酶中处理2小时，保存38%的酶活。研究表明，植酸酶的添加可使植物性饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷排泄量减少40%，还可解除植酸磷的抗营养作用。而单胃动物的胃肠温度一般在37°C左右，胃内pH为2.5，小肠pH为4.(T4.5，与大肠杆菌植酸酶的作用范围与之相近，因而适合作为添加剂加入饲料中，对提高畜牧业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。然而，天然大肠杆菌中植酸酶的酶活太低，难以大量获得植酸酶产品，使得植酸酶产品价格居高不下，严重限制了它在饲料工业中的发展。随着现代生物技术的发展，通过生物反应器来高效表达植酸酶基因，实现了植酸酶产量的提高，同时显著降低了生产成本。但酵母表达对培养条件有一定要求,培养基组成复杂增加了生产成本,且一般诱导100小时才能获得稳定的蛋白表达量；昆虫细胞表达既需要严格的无菌环境，又需要昂贵的培养基， 侵染发生后100小时左右才能获得低表达量的重组蛋白，不利于工业生产。这些问题已经成为现在植酸酶进一步发展的一大难题。
技术实现思路
本专利技术提供一种大肠杆菌植酸酶基因的重组表达载体及重组表达工程菌株。本专利技术一方面提供了来源于大肠杆菌BL21 (DE3)的基因(AM946981.2)的核苷酸序列(SEQ ID N0.1)，核苷酸序列全长1299bp，其中ATG为起始密码子，TAA为终止密码子，4~66bp为编码信号肽序列。该植酸酶基因的核酸序列可用于构建重组载体。所述SEQ ID N0.1的核苷酸序列如下:【权利要求】1.一种植酸酶，其特征在于:其核苷酸序列为SEQ ID N0.1。2.根据权利要求1所述的植酸酶，其特征在于:所述的SEQID N0.1的编码信号肽序列为4~66bp。3.根据权利要求1所述的植酸酶，其特征在于:用于编码该植酸酶的氨基酸，其序列为 SEQ N0.2。4.根据权利要求1所述的植酸酶，其特征在于:所述的SEQN0.2的氨基酸序列酶活性中心为RHGVRAP，含有3个糖基化位点。5.一种植酸酶重组表达工程菌株W，其特征在于:含有权利要求1所述的核苷酸序列进行构建。6.根据权利要求5所述的植酸酶重组表达工程菌株W，其特征在于:表达载体为 pET30a ( + ) -appk, pET30a是表达载体，appA为表达基因片段。7.一种高效表达植酸酶的工程菌株M6，其特征在于:将权利要求5或6所述的植酸酶工程菌株W进行乳糖诱变，后进行目的蛋白表达筛选获得。8.权利要求1所述植酸酶的构建方法，包括以下步骤:(1)大肠杆菌coliBL21 (DE3)基因的获得及重组载体构建；1)制备LB培养基，收集菌体接种到LB培养基上振荡培养，收集菌体；2)提取目的基因；3)测序载体构建；4)表达载体构建；5)通过检测，获得含有阳性重组pET30aC + )-appA质粒的菌株，提取质粒，进行酶切分析，并测序；(2)大肠杆菌植酸酶重组表达工程菌株的获得将测序正确本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植酸酶，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ?ID?NO.1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋和生，韦佩君，潘能庆，杨秀荣，
申请(专利权)人：蒋和生，南宁培元基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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