一种脂肪酶及其重组表达工程菌株制造技术

本发明专利技术提供了一种重组表达脂肪酶的工程菌株。本发明专利技术将从黑曲霉中克隆得到的脂肪酶基因转入里氏木霉中，构建了里氏木霉工程菌，保藏号为CCTCC?NO:M2012483。经重组表达的脂肪酶最适作用pH为5.0，最适作用温度30℃，且对胃液、胃蛋白酶和人工肠液的耐受性增强。本发明专利技术的脂肪酶能显著提高饲料中油脂类物质的利用率，从而能够显著减少饲料中油脂的添加，从而降低饲料成本。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪酶及其重组表达工程菌株
本专利技术属于微生物工程
，具体涉及一种脂肪酶基因及其重组表达工程菌株。
技术介绍
脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构(Schmid等，1998)。脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富 (Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用P H、 作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。脂肪酶具有广泛的应用价值，已成为市场上的第三大工业用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品、医药、日化等工业。 脂肪酶的制备方法有提取法和微生物发酵法(王海燕等，2007，饲料工业)。但是提取法工艺复杂，成本高、效率低。因此，绝大多数脂肪酶均是通过微生物发酵而制备的。现有工业化生产脂肪酶的方法主要有二种一是诱变选育高产的脂肪酶的自然菌株，如解脂亚罗酵母(李珍等，2011，菌物学报；徐宇丽等，2011，微生物学报)；二是构建高产的工程菌(王小峰等，2011，生物工程杂志)。构建基因工程菌是获得高产、高酶活菌株的有效方法之一。目前国内市场上脂肪酶产品多由毕赤酵母异源表达而生产，其优点是发酵工艺成熟；缺点是甲醇诱导存在的安全隐患，还有毕赤酵母表达水平不高，表达水平一般低于7g/l。木霉最常用的工业酶生产菌株之一，其中市场上的纤维素酶绝大多数是由木霉生产的。木霉属于真核生物，具有翻译后修饰系统，如内含子的剪切和糖基化等，因此可以直接表达真核来源的DNA序列、无需删除内含子序列，简化了分子操作。木霉规模化发酵系统优点是(1)分泌表达，便于发酵后处理；(2)深层液体发酵，便于规模化工业发酵；(3)高密度发酵，生产成本低,其最高表达水平可达40g/l。因此，通过构建木霉工程菌，高效重组表达脂肪酶，有望大大降低发酵成本，从而降低脂肪酶对使用成本，促进脂肪酶在饲料添加剂领域的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种脂肪酶及其重组表达工程菌株，即一种从黑曲霉中筛选的新的脂肪酶，以及用于重组表达该脂肪酶的里氏木霉工程菌，经里氏木霉表达后，该酶对胃液、胃蛋白酶和人工肠液的耐受性增强，可将其广泛用作饲料添加剂，提高饲料利用率。本专利技术首先提供一种新型的脂肪酶，其特征在于(a)其氨基酸序列为SEQ ID NO: I的脂肪酶；(b)在(a)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。用于编码上述脂肪酶的基因，其中一种核苷酸序列是SEQ ID N0:2。本专利技术另一方面提供了一种里氏木霉工程菌，用于表达上述的脂肪酶。所述里氏木霉工程菌ZQ-KTrichoderma reesei ZQ-I),已于2012年11月27日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号是=CCTCC Ν0:Μ 2012483。本专利技术的脂肪酶作为饲料添加剂的应用。本专利技术的里氏木霉工程菌能高效表达黑曲霉来源的脂肪酶，20L罐发酵酶活高达 20000U/ml，表达水平超过10g/L。经里氏木霉宿主细胞的修饰，本专利技术的里氏木霉工程菌重组表达的脂肪酶对胃液、胃蛋白酶和人工肠液的耐受性很强，适合作为饲料添加剂使用。附图说明图I :本专利技术的里氏木霉工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图。图2 :本专利技术重组表达脂肪酶的耐受性实验。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例I黑曲霉脂肪酶基因表达载体的构建I. I提取黑曲霉总基因组DNA将黑曲霉(Aspergillus niger)接种摇瓶培养基过夜培养,取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400 μ I抽提缓冲液(100 mM TrisHCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠、在珠打仪剧烈振荡2 min左右；水浴锅 65°C 水浴 20 min 后加入 200μ1 IOM NH4AC 冰浴 10 min ;13000rpm 离心 10 min 取上清，然后加入2倍体积的无水乙醇，-20°C放置30 min ； 13000 rpm离心10 min弃上清， 用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入适量水溶解于_20°C保存。I. 2基因克隆以I. I中提取的基因组总DNA为模板，利用引物anl_F和anl_R (AAAGGTACCATGTTCTCTGGACGGTTTG 和 AGCTCTAGACTATAGCAGA CACTCTGAAATTGC)进行 PCR 扩增。PCR扩增条件为 95°C 4min ；94°C 30S，59°C 40S，72°C Imin 30 个循环；72°C 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。I. 3测序分析将I. 2中回收的扩增产物连接到PMD18-T载体，获得克隆载体pMD-ANL质粒并送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果，扩增产物的基因序列为SEQ ID NO: 2，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO: I。多个克隆的结果证明没有发生扩增错误。I. 4构建载体提取质粒pMD-ANL，用NcoI和KpnI进行双酶切，回收ANL片段；取2 μ I回收产物与NcoI和KpnI双酶切pKDN-5载体连接过夜导入大肠杆菌DH5 α，获得重组表达质粒 pKDN-ANL，测序结果证实插入的片段能够编码序列为SEQ ID NO: I的脂肪酶实施例2转化与筛选I. I原生质体制备接种里氏木霉(Trichoderma reesei )菌丝于PDA平板上生长4天；切取直径约3 cm的菌落置于约60 mlYEG (O. 5%酵母粉、1%葡萄糖)的液体培养基中，30°C、200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有10-20 ml裂解酶液(Sigma L1412)酶解2-3小时；取出酶解液，加入O. 7 M NaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心 10 min ;弃上清，加 10-20 ml STC液(20%蔗糖，50mM Tris-Cl, 50mM CaCl2)悬浮,3000 rpm,离心 10 min ;加适量 STC 悬浮分装(150 μ /管，IO8 个/ml )。I. 2转化与验证取2Pg pKDN-ANL DNA加入到150μ1原生质体中，接着加入500μ1 25%PEG轻轻混匀，室温静本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪酶，其特征在于：所述的脂肪酶（a）其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1；（b）在（a）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶，其特征在于所述的脂肪酶 Ca)其氨基酸序列为SEQ ID NO: I ；(b)在(a)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。2.用于编码权利要求I所述的脂肪酶的基因，其核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄亦钧，张青，徐娟，许丽红，王华明，吴秀秀，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：