用于生产解脂耶氏酵母耐酸重组体脂肪酶的方法，该方法利用的培养基除其使用的物质外不含任何动物来源的产物或未表征的混合物比如胰胨、蛋白胨或抗乳血清。可以生产过多量的脂肪酶Lip2的解脂耶氏酵母的重组菌株被称作YL-LIP2-6C，该菌株于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.)，保藏编号为I-3542，本文还涉及其应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种通过使用产生耐酸的重组体脂肪酶的解脂耶氏酵母(YairowiaIipolytica)细胞来生产脂肪酶的方法，该方法允许生产能用作药物的脂肪酶；本专利技术还涉及一种过度产生耐酸重组体脂肪酶的解脂耶氏酵母菌株及其应用。
技术介绍
人类每日摄取的食品主要由脂类、蛋白质和糖组成。在它们被吸收之前，所有这些组成要经受消化道内的酶的催化水解。这些酶中任何一种的缺乏可以因此引起消化紊乱， 并且导致相当严重的营养不良。即，例如，在一些病态情况的病例中，比如囊性纤维化或外分泌胰腺的不足与胰脂酶缺乏有关。为校正这些缺乏，通常建议口服给药胰腺提取物。然而，这些疗法的效率受限于如下事实这些提取物中所含的酶(脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶)会因胃介质的酸性而快速失活。因此，有人建议使用抗胃环境的脂肪酶制剂，比如，其例子有通过基因工程生产的哺乳动物胃脂肪酶制剂，比如申请人为于文尼尔研究股份公司(INSTITUT DE RECHERCHEJOUVENIAL SA)的法国专利申请公开2699179描述的制剂、或者在酸性介质中具有适当活性的微生物脂肪酶制剂[ZENTLER-M0NR0 等，Pancreas, 7，311-319 (1992)]。在酸性介质中有活性的微生物脂肪酶中，可能会尤其提到真菌脂肪酶，比如来自欧诺比假丝酵母(Candida ernobii) [Y0SHIDA 等,Biochim. Biophys. Acta. ； 154,586-588(1968)]、来自星状丝孢酵母(Trichosporon asteroid)[DHARMSTHITI 等，Biotechnol. Appl. Biochem.，26,111-116 (1997)]、来自爪睡根霉(Rhizopus javanicus)[UYTTENBR0ECK 等，Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254, (1993)]、或来自解脂耶氏酵母[HADEBALL，Acta Biotechnol.，2，159-167(1991) ;NOVOTNY 等，J. Basic Microbiol. 28,221-227(1988)]的那些真菌脂肪酶。除了它们在酸性pH下的活性之外，这些脂肪酶当它们的底物存在时，具有通常的抗蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶)消化的特性，并且具有抵抗胆盐作用的特性(当存在IOmM牛磺胆酸钠时它们的活性可保持)。已经有人描述了解脂耶氏酵母用于生产所研究基因的应用。因此，申请人为INRA和CNRS的专利申请EP 1108043描述了包含所研究基因的表达盒和Zeta序列(zetasequences)的整合载体的应用，该整合载体对应于解脂耶氏酵母Ylt逆转录转座子的LTR序列。这样的表达载体允许将插入所研究基因的数个拷贝非同源地并且分散地整合入缺乏Zeta序列的解脂耶氏酵母菌株的基因组DNA中。该系统尤其已经用于将编码脂肪酶的LIP2基因整合入解脂耶氏酵母DNA，并且已经允许在培养基条件(未详述)下，与未转化的菌株相比，转化菌株分泌的脂肪酶量高出10至15倍。其他研究描述了如专利申请EP 1108043所述的相同表达载体用于在解脂耶氏酵母中产生重组体脂肪酶的应用(国际申请WO 01/83773 ;PIGNEDE等，Journal ofBacteriology, vol. 182，No. 10，p. 2802-2810(2000)以及 PIGNEDE 等，Applied andEnvironmental Microbiology, vol. 66, No. 8, p. 3283-3289 (2000))。具体为-国际申请TO01/83773，申请人为法国米奥里大药厂(Laboratoires MAYOLYSPINDLER)，描述了解脂耶氏酵母MS4克隆(CNCM 1-2294)的产生，该MS4克隆包含被整合入其DNA的10个拷贝的LIP2基因表达盒、并且描述了其用于生产脂肪酶的应用，产率为每升培养液上清液含有0. 5g左右的脂肪酶、以及使用橄榄油作为底物测得的12，000U/ml的催化活性，其中一个活性单位对应于每分钟能够催化释放I U mol脂肪酸的酶量，即，超过原始菌株200倍。然而，该申请所述的产生脂肪酶的方法的主要缺点在于其使用了含有细菌用蛋白胨(bactopeptone)或细菌用胰胨(bactotryptone)的培养基。这些未被表征并且含有各种蛋白质水解物的产物通常用作氮源和碳源。因此，该申请所述的方法不可能得到可以直接用作药物的脂肪酶。 -PIGNEDE 等(Journal of Bacteriology, 2000)更具体地表征了被解脂耶氏酵母(POld菌株)LIP2基因编码的胞外脂肪酶。在本文中描述了下面的研究内容 从各种野生型菌株(缺乏Yltl的POld和含有Yltl的E150)以及从包括JMY184(P01d-6-15)和JMY279(P01d-6-17)在内的各种重组菌株分泌脂肪酶的情况，以及 转化体JMY184的脂肪酶过度产生情况。PIGNEDE等的文章比较了被野生型菌株、突变株和根据如上所述方法(国际申请W001/83773)得到的重组菌株的脂肪酶生产情况。野生型菌株分泌的脂肪酶为30 50U/mL，而在N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NNNG)的作用下得到的突变株在优化培养条件下产生的脂肪酶多出25倍，即1200U/mL的脂肪酶，该优化的培养条件涉及含有蛋白胨的培养基(预培养培养基)和含有乳清的培养基(发酵培养基)(也请参见DESTAIN等，1997)。借助于该表达盒中的包含受P0X2启动子和非同源整合调节的LIP2基因的呈多拷贝和呈分散方式的构造，得到了重组菌株。PIGNEDE等得到了稳定的转化体(例如菌株JMY184)，其在未优化的条件下，即在YPDH培养基(包含10g/L酵母浸膏、10g/L细菌用蛋白胨、10g/L的葡萄糖和10g/L的橄榄油)中产生2000U/mL的脂肪酶，相当于约0. 5g脂肪酶/L上清液。以如上所述相同的方式，PIGNEDE等和DESTAIN等描述的脂肪酶制剂不适用于医疗用途，并且尤其不适合于临床批量的制备，因为它们的生产需要使用含有蛋白胨或乳清的培养基。-在其文献中，PIGNEDE的研究小组(Applied and Environmental Microbiology,2000)研究了用包含LIP2基因表达盒的载体转化的解脂耶氏酵母菌株。该作者发现，对于8种这样的转化体，LIP2基因表达盒的拷贝数在6和16之间(平均10个拷贝)，这导致在不同的基因座处所述表达盒发生2至15次整合。该JMY184菌株因此包含12个拷贝的在4个不同的基因座处整合的LIP2基因表达盒。此外，该作者更具体地研究了该JMY184转化体。他们确认，JMY184菌株在丰富的YPDH培养基(含有细菌用蛋白胨)上培养会产生0. 5g脂肪酶/L上清液，使用橄榄油作为底物进行测量时，该上清液的活性为1500U/mL (相对地，野生型菌株POld为50U/mL)。根据这些数值可以推定脂肪酶的比活性为约3000U/mg。该作者另外报告到，优化JMY184菌株在发酵罐中的脂肪酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于生产重组体脂肪酶的方法，其包括 a)培养用载体转化的解脂耶氏酵母细胞的步骤，所述载体包含用于表达酵母耐酸脂肪酶的表达盒，所得到的解脂耶氏酵母细胞是名为YL-LIP2-6C的克隆，所述克隆于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.)，保藏编号为1-3542 ;以及 b)从培养液上清液中回收用所述YL-LIP2-6C细胞生产的所述重组体脂肪酶的步骤， 该方法的特征在于， 用于培养的步骤a)是在不含由动物来源的蛋白质材料或它们的酶消化产物所组成的动物来源的产物或未被表征的混合物的培养基中进行的；并且所述培养基包含 -作为氮源的无机氮； -碳源，其选自于碳水化合物来源的碳源、多元醇、以及脂类来源的碳源；以及 -无机盐和维生素；并且 所述步骤a)包括 al)在含有碳水化合物来源的碳源的培养基中预培养所述YL-LIP2-6C细胞；a2)发酵步骤，包括在含有碳水化合物来源的碳源的培养基中的细胞生长期，以及在含有脂肪酸作为唯一碳源的培养基中的脂肪酶生产期。2.如权利要求I所述的生产方法，其特征在于，所述无机氮是硫酸铵。3.如权利要求I所述的生产方法，其特征在于，所述脂肪酸是油酸。4.如权利要求I所述的生产方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：伊夫·勒布隆，尼古拉斯·穆兹，阿兰·马蒂，让·路易·乌里韦拉雷亚，
申请(专利权)人：法国米奥里大药厂，
类型：发明
国别省市：
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