本发明专利技术公开了一种热稳定的脂肪酶及制备方法与应用。该脂肪酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的S2‑210脂肪酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的S8‑214脂肪酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的S14‑216脂肪酶或氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的S191‑241脂肪酶。本发明专利技术通过长时间的高温分子动力学模拟模拟耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折叠过程，分析了蛋白解折叠的主要区域和湿熔球态形成的关键步骤，有效的筛选出动力学稳定性改造的关键位点。该热稳定的脂肪酶耐热，半衰期长，特别适合在工业上进行应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程领域，特别涉及一种热稳定的脂肪酶及制备方法与应用。
技术介绍
脂肪酶(EC 3.1.1.3)全称三酰甘油水解酶，被广泛应用于饲料工业、食品加工、化妆品、洗涤剂、生物医学和生物能源等方面。耶氏解脂假丝酵母(Yarrowia lipolytica)是一种非常规酵母，属于食品安全型酵母，目前通过连续基因干扰分析，，已发现其能编码16种脂肪酶Lip2、Lip4、Lip5、Lip7～19。这些脂肪酶同源性大小不一，且性质差异较大。其中，耶氏解脂酵母脂肪酶2(Lip2)是主要的胞外分泌脂肪酶，其对中长链脂肪酸甘油三酯(C12～C16)具有较高的催化活性，被广泛应用于油脂水解、污水处理、食品加工、生物能源、化学合成以及胰腺缺乏症的治疗等多个领域，具有广泛的应用前景，但当环境温度超过40℃时，该脂肪酶迅速失活，在生产加工、储存、运输等过程中造成较大的损失，成为其在工业上应用的主要瓶颈。因此，有必要对耶氏解脂酵母脂肪酶2改造，提高其热稳定性，以拓宽其应用范围。在天然蛋白结构中引入新的二硫键是改造蛋白热稳定性的一种重要方法，被广泛应用于各类蛋白的改造，特别是在药物储存和工业应用改造领域。随着预测二硫键算法的不断发展，其中应用较为广泛的是DbD和MODIP算法，通过对Cβ和Sγ原子进行定位，快速搜索并精确地估算χ3二面角，筛选符合条件的二硫键。这两种算法都是基于静态晶体结构的计算，对二硫键的预测具有高准确性，并且已经成功的应用于米黑根毛霉脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶B、华根霉脂肪酶和铜绿假单胞菌脂肪酶等多种脂肪酶的热稳定性设计，但是对筛选热稳定型二硫键的准确度仍然十分有限。目前对蛋白质热稳定性改造主要分为定向进化、半理性设计和理性设计，其中定向进化和半理性设计需要大量的人力物力，而理性设计需要对蛋白质结构与功能有全面的理解。目前理性设计主要根据蛋白质的晶体静态结构的计算，目前主要利用一下2类筛选方法：(1)基于蛋白质柔性区域的设计，如B-FITTER、FIRST、分子动力学模拟筛选波动较大的区域。(2)基于经验力场对蛋白热力学自由能进行计算，筛选蛋白质热力学稳定的突变位点，如FOLDX力场等。以上均没有深刻理解蛋白质解折叠动力学过程，亦无涉及蛋白质动力学稳定性的设计。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，利用分子动力学模拟筛选出脂肪酶解折叠和湿熔球态形成的关键区域，并分析湿熔球态的形成，有针对性地引入二硫键突变，抑制蛋白湿熔球态和共价聚沉的形成，提高热稳定型二硫键筛选的精确性，并提供一种热稳定的脂肪酶。本专利技术的另一目的在于提供所述热稳定的脂肪酶的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供所述热稳定的脂肪酶的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种热稳定的脂肪酶，是在耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的解折叠和湿熔球态形成的关键区域引入二硫键突变；所述的关键区域为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的第180位～280位氨基酸序列。所述热稳定的脂肪酶优选为S2-210脂肪酶、S8-214脂肪酶、S14-216脂肪酶或S191-241脂肪酶；S2-210脂肪酶的氨基酸序列如下：VCTSTETSHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFHDPRLIFDVSGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFGQECPDVSKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI；S8-214脂肪酶的氨基酸序列如下：VYTSTETCHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFHDPRLIFDVSGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFGQENPDVCKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI；S14-216脂肪酶的氨基酸序列如下：VYTSTETSHIDQECYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFHDPRLIFDVSGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFGQENPDVSKCSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI；S191-241脂肪酶的氨基酸序列如下：VYTSTETSHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFHDPRLIFDVSGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVTLGQPCVGNAGFANWVDKLFFGQENPDVSKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGCQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI。编码所述热稳定的脂肪酶的核苷酸序列，如下所示：S2-210脂肪酶的核苷酸序列如下：gtgtgtacctctaccgagacctctcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttgagctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgatgactgtcttgtccacaatggcttcatc本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种热稳定的脂肪酶，其特征在于：是在耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的解折叠和湿熔球态形成的关键区域引入二硫键突变；所述的关键区域为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的第180位～280位氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种热稳定的脂肪酶，其特征在于：是在耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的解折叠和湿熔球态形成的关键区域引入二硫键突变；所述的关键区域为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的第180位～280位氨基酸序列。2.根据权利要求1所述热稳定的脂肪酶，其特征在于：所述热稳定的脂肪酶为S2-210脂肪酶、S8-214脂肪酶、S14-216脂肪酶或S191-241脂肪酶；S2-210脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；S8-214脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；S14-216脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；S191-241脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.编码权利要求2所述热稳定的脂肪酶的核苷酸序列，其特征在于：所述的S2-210脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述的S8-214脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述的S14-216脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述的S191-241脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。4.权利要求1所述热稳定的脂肪酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)通过Gromacs分子动力学软件模拟耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折叠过程，通过对所得轨迹的波动性分析与蛋白表面水分子的统计，分析出脂肪酶解折叠和湿熔球态形成的关键区域，并进一步对β折叠尾巴区域分区，分析湿熔球态形成的步骤，最后使用Disulfide by Design软件算法筛选潜在二硫键突变位点；(2)通过反向PCR突变，将所选出的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌工程菌中，进行扩增培养与质粒提取、测序；(3)将测序正确的突变质粒以PmeⅠ限制性内...
【专利技术属性】
技术研发人员：管武太，吴炜坤，李力浪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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