EXENDIN-4类似物二聚体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种EXENDIN‑4类似物二聚体及其制备方法和应用，所述二聚体由两个相同或不同的EXENDIN‑4类似物单体通过半胱氨酸形成单体间二硫键制得，所述EXENDIN‑4类似物二聚体的制备，包括采用Fmoc固相多肽合成法合成EXENDIN‑4类似物单体，再将单体形成二聚体；及所述EXENDIN‑4类似物二聚体在制备用于治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症或肥胖症相关疾病的药物中的应用。本发明专利技术的单体形成的EXENDIN‑4类似物二聚体在体内的半衰期可达到14～96小时以上，较单独给药的EXENDIN‑4的半衰期（半衰期仅为2.4小时）明显延长，极大地便利了其临床推广和应用。

EXENDIN-4 analog two polymer and preparation method and application thereof

The invention provides a EXENDIN 4 analogue two polymer and a preparation method and application of the two dimers composed of two identical or different EXENDIN 4 analogues by the monomer monomer formed between two cysteine disulfide bond was prepared, the EXENDIN 4 analogues two dimer preparation using EXENDIN Fmoc, including the synthesis of solid phase peptide synthesis method 4 analogue monomer, then monomer dimer formation of two; and the EXENDIN 4 analogues two dimer in preparation for the treatment of diabetes, application of treatment and / or drugs in the prevention of diseases related to obesity or obesity. The invention of the monomer to form EXENDIN 4 analogues of two dimers in vivo half-life can reach 14 to 96 hours, compared with the single drug EXENDIN 4 half-life (half-life of 2.4 hours) was significantly prolonged, greatly facilitate the clinical popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
EXENDIN-4类似物二聚体及其制备方法和应用
本专利技术涉及糖尿病相关的药物领域，具体而言，本专利技术涉及一种多肽复合物，该多肽复合物能够延长的胰高血糖素样肽（EXENDIN-4）的体内半衰期。本专利技术还涉及该多肽的制备方法及其应用。
技术介绍
糖尿病是一种遗传因素和多种环境因素相关联的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱综合症。由于糖尿病还伴随着诸多并发症，现已成为仅次于恶性肿瘤和心血管疾病之后的第三大健康杀手。1984年，胰高血糖素样肽(EXENDIN-4)类药物被发现，它是一种具有30个氨基酸的肠降血糖素。EXENDIN-4作为降血糖药物受到限制的主要原因是EXENDIN-4的体内半衰期仅为3-5分钟。艾塞那肽（Exenatide）是一条39个氨基酸组成的直链多肽，最初由南美巨蜥的唾液分离提取获得。它的氨基酸残基与哺乳动物EXENDIN-4序列有52%的同源性，其与EXENDIN-4的最大不同之处在于N端第2位的甘氨酸耐血液中二肽基肽酶（DPP-Ⅳ）的酶切作用，而EXENDIN-4的相同位置则为极易被DPP-Ⅳ切断的丙氨酸，故Exenatide被吸收入血后的半衰期较长（t1/2=2.4小时）。Exenatide是一种强效EXENDIN-4受体激动剂，能模拟EXENDIN-4这种内源性多肽的糖调控作用，降低空腹和餐后血糖。Exenatide的活性主要通过与人体胰脏EXENDIN-4受体结合而介导，由环腺苷酸（cAMP）依赖和β细胞分化机制引发葡萄糖依赖的胰岛素合成和分泌。因为Exenatide的氨基酸结构及生物活性与EXENDIN-4均具有相关性，故通常它也被视为肠促胰岛素的一种。由于Exenatide的降糖作用时间较EXENDIN-4长，延缓胃排空和抑制摄食冲动，对肥胖病人体重的有益作用又有别于传统的降糖药物，因此其作为2型糖尿病治疗药物的开发潜力巨大。随着Exenatide为活性单体的药物（艾塞那肽，Lily）于2005年在美国上市，Exenatide作为EXENDIN-4家族中的一员在治疗糖尿病方面引起了广泛的关注。但是，现在上市的Exenatide药物依然存在着半衰期短的问题，药用的Exenatide（艾塞那肽）一般的半衰期只有2.4小时，每日注射两次，极大地增加的患者的痛苦。因此，目前存在对解决Exenatide药物体内半衰期短的方法的需求。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是针对目前Exenatide药物体内半衰期短的不足，提供一种EXENDIN-4类似物二聚体及其制备方法和应用，其在体内的半衰期长，能够更好地治疗糖尿病。针对上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：一方面，本专利技术提供一种EXENDIN-4类似物单体，所述单体为只含有一个半胱氨酸的EXENDIN-4类似物单体，其序列为下述SEQIDNO:1所示的氨基酸序列：HGEX1TFTSDX2SKQX3EEEAVRX4FIEWLKX5GGPSSX6APPPS其中，X1为半胱氨酸或甘氨酸；X2为半胱氨酸或亮氨酸；X3为半胱氨酸或甲硫氨酸；X4为半胱氨酸或亮氨酸；X5为半胱氨酸或天冬酰胺；X6为半胱氨酸或甘氨酸。优选地，所述EXENDIN-4类似物单体选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示的氨基酸序列的EXENDIN-4类似物单体。另一方面，本专利技术提供一种EXENDIN-4类似物二聚体，所述二聚体由两个相同或不同的上述所述的单体通过半胱氨酸形成单体间二硫键。再一方面，本法提供一种EXENDIN-4类似物单体或二聚体的制备方法，所述方法包括：采用Fmoc固相多肽合成法合成EXENDIN-4类似物单体；优选地，当制备EXENDIN-4类似物二聚体时，还包括将制得的EXENDIN-4类似物单体通过碳酸氢铵或其他还原剂来形成单体间二硫键的步骤；优选地，所述采用Fmoc固相多肽合成法是以固相载体树脂为载体，从C端即羧基端向N端即氨基端逐渐添加氨基酸的过程。本专利技术中优选树脂：Fmoc-wang树脂、2-cl-trt树脂，树脂取代度0.10~0.34。本专利技术所使用的保护氨基酸为：Fmoc-Tyr（tBu）-OH，Fmoc-Ile-OHFmoc-leu（tBu）-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Lys（Boc）-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Arg（pbf）-OH，Fmoc-Ser（tBu）-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Cys（Trt）-OH，Fmoc-Gln（Trt）-OH，Fmoc-Asn（trt）-OH，Fmoc-Trp（tBu）-OH，Fmoc-Asp-OH和Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，反应过程中保护氨基酸3~5倍过量。本专利技术所使用的脱保护试剂为：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，比例为10:90~30:70。本专利技术所使用的偶联试剂为：①苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑(HOBT)，②2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基苯并三唑(HOBT),③N,N'-二异丙基碳二亚胺。本专利技术中，若使用第①或者第②种偶联试剂，那么反应中过程中应添加缚酸剂：DIEA/NMP。本专利技术中所使用的切割试剂为：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1,2-乙二硫醇，比例为：82.5:5:5:5:2.5。本专利技术中使用MS-IT-TOF确定分子量，使用HPLC纯化粗肽。还一方面，本专利技术一种用于治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症或肥胖症相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有上述所述的EXENDIN-4类似物二聚体和药学上可接受的辅料。优选地，所述辅料选自水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂。优选地，所述药物组合物为注射剂。优选地，所述药物组合物注射剂为冻干粉针或溶液注射剂。又一方面，本专利技术提供一种上述EXENDIN-4类似物单体或二聚体在制备用于治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症或肥胖症相关疾病药物中的应用。还一方面，本专利技术提供一种上述药物组合物在制备用于治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症或肥胖症相关疾病的药物中的应用。优选地，本专利技术上述所述的药物的用药剂量为5μg～1mg/人/次。以下是本专利技术的详细描述：（1）含有半胱氨酸的EXENDIN-4单体本专利技术所述的EXENDIN-4类似物二聚体，该二聚体由两个均含有一个半胱氨酸的EXENDIN-4类似物单体通过半胱氨酸二硫键形成，所述EXENDIN-4类似物单体的序列为下述SEQIDNO:1所示的氨基酸序列：SEQIDNO:1：HGEX1TFTSDX2SKQX3EEEAVRX4FIEWLKX5GGPSSX6APPPS上述SEQIDNO:1的EXENDIN-4单体为人工序列，分别及仅在第4、10、14、21、28或34位氨基酸上进行了修饰，由半胱氨酸取代了原有的氨基酸。形成如下含有半胱氨酸的EXENDIN-4单体，序列如下：SEQIDNO:2:HGECTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSSEQIDNO:3:HGEGTFTS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种EXENDIN‑4类似物二聚体，所述二聚体由两个相同或不同的EXENDIN‑4类似物单体通过半胱氨酸形成单体间二硫键制得；其中，所述EXENDIN‑4类似物单体选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种EXENDIN-4类似物二聚体，所述二聚体由两个相同或不同的EXENDIN-4类似物单体通过半胱氨酸形成单体间二硫键制得；其中，所述EXENDIN-4类似物单体选自SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。2.一种制备根据权利要求1所述的EXENDIN-4类似物二聚体的制备方法，所述方法包括：采用Fmoc固相多肽合成法合成EXENDIN-4类似物单体。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当制备EXENDIN-4类似物二聚体时，还包括将制得的EXENDIN-4类似物单体通过碳酸氢铵或其他还原剂来形成单体间二硫键的步骤。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述固相合成是以固相载体树脂为载体，从C端即羧基端向N端即氨基端逐渐添加氨基酸的过程。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述树脂为Fmoc-wang树脂或2-cl-trt树脂。6.如权利要求2～5的任一项所述的方法，其特征在于，所述固相合成中使用的脱保护试剂为：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，其比例为10:90～30:70。7.如权利要求2～5的任一项所述的方法，其特征在于，所述固相合成中使用的偶联试剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑(HOBT)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基苯并三唑...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉丽，郑学敏，黄长江，龚珉，徐为人，汤立达，
申请(专利权)人：天津药物研究院，
类型：发明
国别省市：天津,12