本发明专利技术提供一种胸腺法新的合成工艺，属多肽固相合成领域，其特征在于：首先将AM树脂进行改造，在AM树脂上偶联2‑6个侧链保护亲水氨基酸残基，亲水性氨基酸为Lys，Arg、Glu、Asp氨基酸，然后将Rink amide Linker偶联至树脂，制备Fmoc‑ AAn···AA2 – AA1‑AM树脂，延长合成多肽与树脂线性距离，增加树脂亲水性；将改造的树脂用于胸腺法新的合成，胸腺法新固相合成采用从C端至N端线性连续合成，通过控制氨基酸过量倍数和偶联时间达到最佳合成效率，肽链合成完成后最后脱Fmoc保护，乙酸酐乙酰化多肽N端，用裂解试剂裂解，乙醚沉淀获得胸腺法新。本发明专利技术方法制备的树脂在进行胸腺法新合成时表现高效，能很好的消除胸腺法新在固相合成过程中β折叠的发生。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及固相多肽合成，尤其涉及一种胸腺法新的固相合成工艺。
技术介绍
胸腺法新(thymalfasin)是从胸腺中分离的一个28个氨基酸残基的多肽，该多肽N端乙酰化，C端为游离羧基，分子量3108Da。胸腺法新促进骨髓干细胞分化，诱导T淋巴细胞分化成熟，研究表明，胸腺法新是胸腺肽中生物活性最强组分，是一种理想的免疫调节剂。目前胸腺法新已用于治疗慢性病毒性肝炎、肝癌以及免疫力低下等疾病治疗。目前胸腺法新的合成方法主要采用Fmoc固相合成，其中采用羟基树脂进行合成的方法较多，如中国专利CN102199205A，采用该方法存在一定比例DKP的发生，导致产量下降，同时由于胸腺法新是困难多肽，在合成过程中形成β折叠，导致合成困难，纯度和产量均较低；中国专利CN201410105039通过在王树脂上增加0-8个氨基酸，然后连接HMPALinker，能较好的抑制DKP的发生，提高收率。另外一种方法则采用酰氨树脂，如中国专利CN101104638A，通过偶联Fmoc-Asp-OtBu，其余氨基酸的合成和羟基树脂一致，该方法能够有效消除DKP的发生，使产率和纯度均有所提高，但由于困难序列的存在，导致合成成本高，杂质难分离等问题。因此，本领域迫切需要提供一种简便有效的胸腺法新合成工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种胸腺法新的固相合成工艺。本专利技术的技术方案是：一种胸腺法新合成工艺，其特征在于：首先将AM树脂进行改造，在AM树脂上偶联2-6个侧链保护亲水氨基酸残基，亲水性氨基酸为Lys，Arg、Glu、Asp氨基酸，然后将RinkamideLinker偶联至树脂，制备Fmoc-AAn···AA2–AA1-AM树脂，延长合成多肽与树脂线性距离，增加树脂亲水性；将改造的树脂用于胸腺法新的合成，胸腺法新固相合成采用从C端至N端线性连续合成，通过控制氨基酸过量倍数和偶联时间达到最佳合成效率，肽链合成完成后最后脱Fmoc保护，乙酸酐乙酰化多肽N端，用裂解试剂裂解，乙醚沉淀获得胸腺法新。本专利技术首先将AM树脂进行改造，包括如下步骤：A）在活化剂存在下，由AM树脂和Fmoc保护氨基酸偶联得到Fmoc-AA1-AM树脂；B）乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液封闭；C）哌啶/DMF溶液脱保护；D）在活化剂存在下，由Fmoc-AA1-AM树脂和Fmoc保护氨基酸偶联得到Fmoc-AA–AA1-AM树脂；E）重复B)C)D)步骤获得Fmoc-AAn···AA2–AA1-AM树脂；F）乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液封闭；G）哌啶/DMF溶液脱保护；H）在活化剂存在下，RinkamideLinker和步骤F)所得树脂偶联获得树脂；I）乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液封闭，测定替代值。本专利技术利用改造后的树脂进行新腺法新合成，包括如下步骤：①改造后的树脂膨化后，20%哌啶/80%DMF溶液去保护；②在活化剂存在下，Fmoc-Asp-OtBu与树脂偶联得到Fmoc-Asp-(树脂)-OtBu；③其余氨基酸按照常规方法依次偶联；④20%哌啶/80%DMF溶液去保护；⑤乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液乙酰化；⑥裂解采用TFA/DMB/水溶液进行裂解；冷乙醚沉淀获得胸腺法新粗品。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤A）中，所用RinkAmide树脂替代度为0.8-1.1mmol/g。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤A）和D）中，依次偶联采用的偶联剂为DIEA/HCTU/HOBt。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤C）和G）中，每步的去Fmoc基团试剂为50%哌啶/DMF溶液。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤I）中，树脂替代度为0.05-0.5mmol/g。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤②中，所用的Fmoc-Asp-OtBu为树脂的10倍量，偶联时间为2小时。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤③中，第8位Ser，第10位、第18位和第21位Glu，第16位Leu、第17位和第19位Lys氨基酸为树脂6倍量，偶联时间为1.5小时。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤⑥中，裂解液TFA含量90-95%，DMB含量2.5-5%，水含量2.5-5%。采用上述技术方案，具有操作简单，成本低廉等优点，适合大规模生产。本专利技术方法制备的树脂在进行胸腺法新合成时表现高效，能很好的消除胸腺法新在固相合成过程中β折叠的发生。附图说明图1为树脂改造流程图。图2为胸腺法新合成路线图。图3为胸腺法新HPLC纯化图。图4为胸腺法新合成粗品质谱图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。AM树脂、链接剂、各种保护氨基酸以及偶联剂均购自上海吉尔生化有限公司，说明书和权利要求书中所用英文缩写的含义见下表。实施例一Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的合成称取替代值1.1mmol/gAM树脂10克，DMF膨化30分钟，抽干，称取44mmolFmoc-Lys(Boc)-OH，44mmolHCTU和44mmolHOBt，量取88mmolDIEA，用60毫升DMF将氨基酸和HCTU以及HOBt溶解，滴加DIEA，混匀后冰浴冷却，活化15分钟后加入膨化好的树脂，反应12小时，茚三酮检测阴性后终止反应；配置60毫升封闭液（20mmol乙酸酐，200mmol三乙胺溶于DMF中，定容至60毫升），加入树脂中，室温反应1小时。封闭好的树脂用50%哌啶DMF溶液去保护15分钟，DMF清洗8次，进行第二个Fmoc-Lys(Boc)-OH的偶联，重复偶联完成4个Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联后测定替代值，替代值为0.2mmol/g。实施例二Rinkamide-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的合成实施例一制备的树脂加入20%哌啶DMF溶液去保护，去保护时间15分钟，去保护完成后DMF洗涤8次至完全干净；称取4mmolRinkamideLinker，4mmolHCTU，量取8mmolDIEA，用10毫升DMF将RinkamideLinker和HCTU溶解，滴加DIEA，混匀后冰浴冷却，活化15分钟后加入去保护的树脂，增加DMF至树脂完全覆盖，反应3小时，10毫升封闭液封闭30分钟，洗涤后冻干，测定替代值，替代值为0.12mmol/g。实施例三Fmoc-Asp(Rinkamide-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM)-OtBu的合成称取实施例二制备的Rinkamide-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂8.3g，加入20%哌啶DMF溶液去保护，去保护时间15分钟，去保护完成后DMF洗涤8次至完全干净；称取Fmoc-Asp-OtBu4.115g，HCTU4.137g，HOBt1.35g，加入15mlDMF溶解，滴加3.3mlDIEA，冰浴活化15分钟，加入准备好的树脂中偶联2小时，茚三酮试剂检测树脂为无色透明，说明反应完成，洗涤树脂。实施例四全保护肽树脂的合成实施例三制备的Fmoc-Asp(Rinkamide-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胸腺法新合成工艺，其特征在于：首先将AM树脂进行改造，在AM树脂上偶联2‑6个侧链保护亲水氨基酸残基，亲水性氨基酸为Lys，Arg、Glu、Asp氨基酸，然后将Rink amide Linker偶联至树脂，制备Fmoc‑ AAn···AA2 – AA1‑AM树脂，延长合成多肽与树脂线性距离，增加树脂亲水性；将改造的树脂用于胸腺法新的合成，胸腺法新固相合成采用从C端至N端线性连续合成，通过控制氨基酸过量倍数和偶联时间达到最佳合成效率，肽链合成完成后最后脱Fmoc保护，乙酸酐乙酰化多肽N端，用裂解试剂裂解，乙醚沉淀获得胸腺法新。
【技术特征摘要】
1.一种胸腺法新合成工艺，其特征在于：首先将AM树脂进行改造，在AM树脂上偶联2-6个侧链保护亲水氨基酸残基，亲水性氨基酸为Lys，Arg、Glu、Asp氨基酸，然后将RinkamideLinker偶联至树脂，制备Fmoc-AAn···AA2–AA1-AM树脂，延长合成多肽与树脂线性距离，增加树脂亲水性；将改造的树脂用于胸腺法新的合成，胸腺法新固相合成采用从C端至N端线性连续合成，通过控制氨基酸过量倍数和偶联时间达到最佳合成效率，肽链合成完成后最后脱Fmoc保护，乙酸酐乙酰化多肽N端，用裂解试剂裂解，乙醚沉淀获得胸腺法新。2.根据权利要求1所述的胸腺法新合成工艺，其特征在于：将AM树脂进行改造，包括如下步骤：A)在活化剂存在下，由AM树脂和Fmoc保护氨基酸偶联得到Fmoc-AA1-AM树脂；B)乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液封闭；C)哌啶/DMF溶液脱保护；D)在活化剂存在下，由Fmoc-AA1-AM树脂和Fmoc保护氨基酸偶联得到Fmoc-AA2–AA1-AM树脂；E)重复B)C)D)步骤获得Fmoc-AAn···AA2–AA1-AM树脂；F)乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液封闭；G)哌啶/DMF溶液脱保护；H)在活化剂存在下，RinkamideLinker和步骤F)所得树脂偶联获得树脂；I)乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液封闭，测定替代值。3.根据权利要求1或2所述的胸腺法新合成工艺，其特征在于：利用改造后的树脂进行胸腺法新合成，包括如下步骤：改造后的树脂膨...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘宇，
申请(专利权)人：岳阳新华达制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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