本发明专利技术公开了一种固相合成胸腺法新的制备方法。本发明专利技术涉及Fmoc策略固相法制备胸腺法新的一种新型工艺。包括以下步骤：（1）由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的RinkAmideMBHA树脂开始合成Fmoc-Asp(RinkAmideMBHA树脂)-OtBu。（2）将Fmoc-Asp(RinkAmideMBHA树脂)-OtBu采用逐一偶联或是片段法偶联的方式合成得到胸腺法新肽树脂，其中Glu18、Lys19两个氨基酸的偶联采用片段法一步接肽，其余的氨基酸采用逐一偶联；在Asp6、Thr12、Leu16、Lys17、Glu18-Lys19等偶联之前的去保护采用混合去保护试剂进行去保护；在偶联Asp2之前对肽树脂进行特殊的酰化试剂进行封端。（3）对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP-HPLC纯化、转盐、冻干得到胸腺法新。本发明专利技术提供了一种产品纯度高、易于纯化的胸腺法新固相合成方法。
【技术实现步骤摘要】
一种合成胸腺法新的方法
本专利技术涉及一种胸腺法新的固相合成方法。
技术介绍
胸腺法新(Thymosinα1，也称胸腺肽α1)是胸腺素主要生物活性成分，为体内重要免疫调节物质，是氮端乙酰化的28个氨基酸组成的多肽。研究表明，胸腺法新促进骨髓干细胞发育分化为原淋巴细胞及前淋巴细胞；诱导T淋巴细胞分化与成熟，使已成熟的T细胞进一步分化为几个不同的亚群，如杀伤细胞、记忆细胞、效应细胞、辅导T淋巴细胞等，并产生各种可溶性介质；增强淋巴细胞对有丝分裂素的反应，并可增加淋巴组织的蛋白质和核酸的合成；增加r-IFN、a-IFN、IL-2、IL-3和淋巴毒素的生成，增强抗病毒和抗肿瘤的免疫反应；抑制自身免疫反应；恢复抑制性T细胞的功能。目前胸腺法新已被广泛应用于临床，治疗多种疾病，如用于慢性乙型肝炎的治疗；用于丙型肝炎、肝细胞癌、恶性黑色素瘤的治疗；用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗。US4517119采用全液相法合成、纯化胸腺法新。氨基酸氮端采用苄基保护，每次去保护都采用Pd催化加氢进行，操作极其繁杂，未给出总收率。US4504415采用全液相法合成、反相HPLC纯化胸腺法新。以18肽片段（11-28肽段）为起始原料计算总收率为12%。US5856440以MBHA树脂为载体，采用氮端保护为Moz（4-甲氧基苄氧甲酰基）的氨基酸进行胸腺法新固相合成。相比Boc法合成，Moz比Boc更容易脱去。因此Moz法合成多肽过程中，可降低因多次去保护造成肽链从树脂上的流失。从而提高总合成收率。Moz法合成胸腺法新收率35%，比Boc法的25%高。CN101484467采用CTC树脂合成胸腺法新。合成时，在序列11-12处的Ile-Thr采用假脯氨酸二肽形式进行合成。最终合成收率40%。CN102199205采用Wang树脂合成胸腺法新，其采用逐步法合成胸腺法新，其粗肽纯度为69.6%，合成收率为56.6%。若采用PEG衍生后的Wang树脂进行合成，则粗肽纯度为57.2%，合成收率为64.4%。未报道总收率。CN1291031采用生物工程法合成胸腺法新，并与商品胸腺法新进行了活性对比。这些现有的合成方法存在的共有技术难点为：（1）液相合成胸腺法新工艺操作复杂，费时费力，不利于工业化生产；（2）现有固相合成法，多通过逐一偶联方式获得胸腺法新肽树脂。由于多个困难点（Leu16、Lys17、Glu18、Lys19等）的存在使粗肽纯度较低，容易包含与胸腺法新保留性质相近的杂质而造成HPLC纯化难度增大，总收率不高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种胸腺法新的固相合成方法。本专利技术需要解决的技术问题是：选择一条合适的工艺路线，解决以下技术问题：（1）液相合成胸腺法新工艺操作复杂，费时费力，不利于工业化生产；（2）现有固相合成法后期纯化难度大，产品纯度低、收率不高。本专利技术的制备方法如图1所示，首先由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的RinkAmideMBHA树脂开始合成Fmoc-Asp(RinkAmideMBHA树脂)-OtBu，然后将Fmoc-Asp(RinkAmideMBHA树脂)-OtBu采用逐一偶联的方式合成得到胸腺法新肽树脂，再采用醋酸酐/吡啶进行氮端乙酰化；最后对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP-HPLC纯化得到高纯度胸腺法新溶液、再经RP-HPLC转盐、冷冻干燥得到胸腺法新成品。本专利技术中一些常用的缩写具有以下含义；Ac2O：醋酸酐Pyridine：吡啶Boc：叔丁氧羰基Fmoc：9-芴甲氧羰基tBu：叔丁基Fmoc-AA-OH：9-芴甲氧羰基保护的氨基酸Cl-HOBt：6-氯-1-羟基苯并三唑DIC：N，N′-二异丙基碳化二亚胺Asp：天冬氨酸Glu：谷氨酸Ala：丙氨酸Val：缬氨酸Lys：赖氨酸Leu：亮氨酸Thr：苏氨酸Ser：丝氨酸Ile：异亮氨酸DMF：N，N′-二甲基甲酰胺Piperidine：六氢吡啶TFA：三氟醋酸TIS:三异丙基硅烷MeOH：甲醇DCM：二氯甲烷Knisertest检测试剂为：茚三酮HOAc：乙酸ACN：乙腈为此，本专利技术提供一种固环合成胸腺法新的方法，所述方法步骤如下：步骤1，应用Fmoc/tBu方法，在树脂上以固相合成胸腺法新肽树脂；步骤2，以二肽片段形式引入Glu18、Lys19两个氨基酸残基；步骤3，在Asp6、Thr12、Leu16、Lys17、Glu18-Lys19等偶联之前的去保护采用混合去保护试剂DBU/哌啶/DMF溶液进行2次去保护反应，且去保护反应时间为第一次15min，第二次去保护反应30min；步骤4，在偶联完Asp2并洗涤之后，对肽树脂进行特殊酰化试剂丙酰氯等进行封端操作。步骤5，对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP-HPLC纯化、转盐、冻干得到胸腺法新。其中，步骤1所述胸腺法新树脂，结构如下：Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(NH-Resin)-OtBu其中，步骤2所述二肽片段形式通过Fmoc-Glu(OtBu）-Lys(Boc)-OH进行偶联；其中，步骤3所述混合去保护试剂为如哌啶/DMF溶液、DBU/DMF溶液或DBU/哌啶/DMF溶液等，优选DBU/哌啶/DMF=1/5/20(体积比)。且去保护采用2次进行，第一次反应15min，温度25℃；第二次反应30min，温度25℃；其中，步骤4所述酰化试剂为丙酰氯、丁酰氯、对甲苯磺酰氯，优选丙酰氯。反应条件为酰氯采用10eq投料，20℃下反应15min。其中，步骤5所述裂解采用裂解剂：TIS和TFA，其配置比例为TIS/TFA=5/95，且裂解剂的体积数为胸腺法新肽树脂质量数的10倍。反应时间为1小时，反应温度为25℃。裂解剂配制方法为：将5体积TIS加入到95体积的TFA中。本专利技术通过筛选得到特定合成方式的组合，即将片段法、加强去保护反应条件、特殊试剂封端等条件联合使用，得到一种高收率且易于纯化的胸腺法新合成方法。以下通过实验数据说明本专利技术的有益效果：逐步法与片段法筛选：由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的RinkAmideMBHA树脂开始合成Fmoc-Asp(RinkAmideMBHA树脂)-OtBu，然后将Fmoc-Asp(RinkAmideMBHA树脂)-OtBu采用逐一偶联的方式合成得到胸腺法新肽树脂，再采用醋酸酐/吡啶进行氮端乙酰化；最后对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到胸腺法新粗肽。对粗肽进行取样检测。其中在18、19两个位置残基偶联时分别采用了以下两种方式：先偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH，再偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH的逐步法；以及Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OH片段法。使用上述条件制备目的肽，分别得到不同收率和纯度的胸腺法本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种合成胸腺法新的方法，所述方法步骤如下：步骤1，由Fmoc‑Asp‑OtBu和合适替代度的Rink Amide MBHA 树脂开始合成Fmoc‑Asp(Rink Amide MBHA树脂)‑OtBu；步骤2，根据胸腺法新肽序碳端到氮端的次序，在树脂Fmoc‑Asp(Rink Amide MBHA树脂)‑OtBu上采用逐一偶联方式或是片段法进行所有氨基酸的连接，得到胸腺法新肽树脂；步骤3，对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP‑HPLC纯化、转盐、冻干得到胸腺法新。
【技术特征摘要】
1.一种合成胸腺法新的方法，所述方法步骤如下：步骤1，由Fmoc-Asp-OtBu和替代度0.40-0.50mmol/g的RinkAmideMBHA树脂在DIC/Cl-HOBt作用下合成Fmoc-Asp(RinkAmideMBHA树脂)-OtBu；步骤2，根据胸腺法新肽序碳端到氮端的次序，在树脂Fmoc-Asp(RinkAmideMBHA树脂)-OtBu上进行氨基酸的连接，偶联完所有氨基酸得到胸腺法新28肽树脂，采用醋酸酐/吡啶进行氮端乙酰化得到胸腺法新肽树脂；其中，在Glu18、Lys19两个氨基酸的偶联时，采用片段法，使用Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OH一步偶联完成；在Asp6、Thr12、Leu16、Lys17、Glu18-Lys1...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨东晖，路杨，陈晓航，沈珂，
申请(专利权)人：杭州诺泰制药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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