制备高纯度胸腺法新的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备高纯度胸腺法新的方法。首先分别制备多肽片段一树脂、多肽片段二树脂、多肽片段三树脂、多肽片段四树脂和多肽片段五树脂；将多肽片段二、三、四和五树脂进行裂解，得到各粗多肽片段；将得到的粗多肽片段二、三、四和五分别纯化；将纯化后的各多肽片段连接到多肽片段一树脂上；将连接后多肽片段树脂进行乙酰化反应，得到胸腺法新wang树脂；进行裂解，得到胸腺法新粗品；将所得胸腺法新粗品进行两次纯化；收集纯化过程中含胸腺法新的流动相减压蒸干，离心后得到胸腺法新，真空干燥得到胸腺法新成品。利用本发明专利技术制备胸腺法新，有效地缩短了反应时间，提高了反应收率和最终产品的质量；制备的胸腺法新纯度达到99%以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽固相合成
，具体涉及一种制备高纯度胸腺法新的方法。
技术介绍
胸腺肽是胸腺组织分泌的具有生理活性的一组多肽，能促进淋巴细胞转化，增强巨噬细胞吞噬活性，可用于治疗多种免疫缺陷病。胸腺法新的化学结构式为：Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。单用胸腺法新治疗慢性乙肝中内外有研究表明，单用胸腺法新治疗慢性乙肝，持续应答率在37%左右，与单用干扰素相近，不过没有干扰素的毒副作用。在中国台湾应用胸腺法新治疗慢性乙肝的临床研究表明：胸腺法新具有延迟的治疗效应。当胸腺法新治疗结束后，ALT有一过性升高，同时伴有HBeAg的血清转换，HBV DNA消失。HBV DNA转阴率及血清转换优越性的研究结果表明：单用胸腺法新治疗慢性乙肝有长期疗效，而没有明显不良反应。对于晚期肝纤维化患者，高剂量的胸腺法新治疗效果较好。目前化学合成胸腺肽主要有固相合成法，该方法虽然比较成熟，但是采用该固相合成法来合成多肽是非常困难的。 
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种高效制备高纯度胸腺法新的方法。利用本专利技术技术方案制备胸腺法新，有效地缩短了反应时间，提高了反应收率和最终产品的质量。利用本专利技术技术方案制备的胸腺法新纯度达到99%以上。为了解决上述问题，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供一种制备高纯度胸腺法新的方法，所述制备方法包括以下步骤：（1）、多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂的制备：a、首先将Fmoc-Asn（Trt）-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Asn（Trt）-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；c、将步骤b脱保护洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Asn（Trt）-wang resin树脂、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Ala-OH 氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Val-OH氨基酸、Fmoc-Val-OH氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸和Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂；（2）、多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-Ile树脂的制备：a、首先将Fmoc-Lys（Boc）-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Lys（Boc）-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Leu-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Lys（Boc）-wang resin树脂、Fmoc-Leu-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸、Fmoc-Thr（tBu）-OH氨基酸、Fmoc-Thr（tBu）-OH氨基酸和Fmoc-Ile-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-Ile树脂；（3）、多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂的制备：a、首先将Fmoc-Glu-（OtBu）-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Glu-（OtBu）-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Glu-（OtBu）-wang resin树脂、Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂；（4）、多肽片段四Thr-Asp-Val树脂的制备：a、首先将Fmoc-Thr（tBu）-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Thr（tBu）-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备高纯度胸腺法新的方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：（1）、多肽片段一Asn‑Glu‑Ala‑Glu‑Glu‑Val‑Val‑Glu‑Lys‑Lys‑Glu树脂的制备：a、首先将Fmoc‑Asn（Trt）‑wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc‑Asn（Trt）‑wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；c、将步骤b脱保护洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc‑Glu（OtBu）‑OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc‑Asn（Trt）‑wang resin树脂、Fmoc‑Glu（OtBu）‑OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc‑Ala‑OH 氨基酸、Fmoc‑Glu（OtBu）‑OH氨基酸、Fmoc‑Glu（OtBu）‑OH氨基酸、Fmoc‑Val‑OH氨基酸、Fmoc‑Val‑OH氨基酸、Fmoc‑Glu（OtBu）‑OH氨基酸、Fmoc‑Lys（Boc）‑OH氨基酸、Fmoc‑Lys（Boc）‑OH氨基酸和Fmoc‑Glu（OtBu）‑OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段一Asn‑Glu‑Ala‑Glu‑Glu‑Val‑Val‑Glu‑Lys‑Lys‑Glu树脂；（2）、多肽片段二Lys‑Leu‑Asp‑Lys‑Thr‑Thr‑Ile树脂的制备：a、首先将Fmoc‑Lys（Boc）‑wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc‑Lys（Boc）‑wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc‑Leu‑OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc‑Lys（Boc）‑wang resin树脂、Fmoc‑Leu‑OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc‑Asp（OtBu）‑OH氨基酸、Fmoc‑Lys（Boc）‑OH氨基酸、Fmoc‑Thr（tBu）‑OH氨基酸、Fmoc‑Thr（tBu）‑OH氨基酸和Fmoc‑Ile‑OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段二Lys‑Leu‑Asp‑Lys‑Thr‑Thr‑Ile树脂；（3）、多肽片段三Glu‑Ser‑Ser树脂的制备：a、首先将Fmoc‑Glu‑（OtBu）‑wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc‑Glu‑（OtBu）‑wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc‑Ser（tBu）‑OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc‑Glu‑（OtBu）‑wang resin树脂、Fmoc‑Ser（tBu）‑OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc‑Ser（tBu）‑OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段三Glu‑Ser‑Ser树脂；（4）...

【技术特征摘要】
1.一种制备高纯度胸腺法新的方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）、多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Asn（Trt）-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Asn（Trt）-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Asn（Trt）-wang resin树脂、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Ala-OH 氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Val-OH氨基酸、Fmoc-Val-OH氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸和Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂；
（2）、多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-Ile树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Lys（Boc）-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Lys（Boc）-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Leu-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Lys（Boc）-wang resin树脂、Fmoc-Leu-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸、Fmoc-Thr（tBu）-OH氨基酸、Fmoc-Thr（tBu）-OH氨基酸和Fmoc-Ile-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-Ile树脂；
（3）、多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Glu-（OtBu）-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Glu-（OtBu）-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Glu-（OtBu）-wang resin树脂、Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂；
（4）、多肽片段四Thr-Asp-Val树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Thr（tBu）-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Thr（tBu）-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Thr（tBu）-wang resin树脂、Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Val-OH氨基酸连接到多肽片段上，得到多肽片段四Thr-Asp-Val树脂；
（5）、多肽片段五Ala-Ala-Asp-Ser树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Ala-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宝国，李沁沁，王艳侨，翟腾，朱赞梅，张亚惠，苗海敏，王娜，
申请(专利权)人：郑州大明药物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41