一种胸腺五肽的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种胸腺五肽新的制备方法，具体涉及胸腺五肽的固相多肽合成制备方法。包括如下步骤：以羟甲基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，第一个氨基酸采用Fmoc-Tyr-OH，以TBTU为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH；切肽，提纯，获得目标产物。本发明专利技术采用羟甲基树脂为固相载体，以Fmoc保护的氨基酸为单体，第一个氨基酸采用Fmoc-Tyr-OH，不需要侧链保护，以TBTU为缩合剂，逐个接上氨基酸，每步接肽收率≥98%，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH,降低了生产成本，简化工艺，用2NHCl/HAc切肽，加乙酸乙酯沉淀粗品，条件温和，三废污染少。

【技术实现步骤摘要】
一种胸腺五肽的制备方法
本专利技术涉及一种胸腺五肽新的制备方法，具体涉及胸腺五肽的固相多肽合成制备方法。
技术介绍
胸腺五肽，英文名为Thymopoietinpentapeptide;TP-5;Thymopentin，结构式为Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH，分子式及分子量：C30H49N9O9，679.77。胸腺五肽是胸腺生成素Ⅱ(Thy-mopoietinⅡ)第32～36位的氨基酸残基片段,它的基本序列为H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH,保留了胸腺生成素的有效生物活性。有关TP-5的生物活性和免疫功能国内外已有很多报道。TP5为细胞免疫调节药物,具有诱导T细胞分化,促进T淋巴细胞亚群发育并活化的功能。它可增强巨噬细胞吞噬功能及增强红细胞免疫功能,提高自然杀伤细胞活性和白介素-2的产生水平与受体表达水平,增强外周血单核细胞γ-干扰素的产生,增强血清中超氧化物歧化酶活性。胸腺五肽临床用于免疫增强剂，用于艾滋病早期治疗，慢性肝炎，恶性肿瘤，手术及严重感染，还可用于糖尿病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、肾小球肾炎、多发性硬化等自身免疫性疾病，还具有抗衰老作用等。胸腺五肽的合成大部分是采用固相合成方法。目前，常规的胸腺五肽的制备方法是以氯甲基树脂或wang树脂为起始原料，与叔丁氧羰基保护的酪氨酸反应生成酪氨酸树脂，再依次将保护缬氨酸、保护天冬氨酸、保护赖氨酸、保护精氨酸进行缩合反应，生成保护TP-5树脂，再与切肽试剂反应，使TP-5从树脂上脱下，经提纯后得到TP-5产品。上述方法存在明显缺陷，接肽收率低，生产成本高，工艺复杂，例如，使用叔丁氧羰基保护的酪氨酸，其价格比未进行侧链保护的酪氨酸高50%；三废污染严重，使用巯基类化合物作清除剂，使用剧毒的氟化氢和三氟乙酸等。上述方法难以进行工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种固相多肽合成胸腺五肽制备方法，大幅度减少三废和降低原料成本，提高反应收率，以克服现有技术存在的上述缺陷。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种胸腺五肽的制备方法，包括如下步骤：以羟甲基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，第一个氨基酸采用Fmoc-Tyr-OH，以TBTU为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH；切肽，提纯，获得目标产物。一种胸腺五肽的制备方法，包括如下步骤：（1）以羟甲基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，第一个氨基酸采用Fmoc-Tyr-OH，以TBTU为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH，（2）将2NHCl/HAc加入步骤（1）的产物进行切肽，加入乙酸乙酯沉淀，过滤、洗涤得五肽粗品；（3）将步骤（2）的粗品采用C18柱进行分离纯化，流动相采用：2%硫酸铵-甲醇溶液；（4）将上柱收集得到的合格溶液，减压浓缩至原体积的十分之一，加乙酸乙酯沉淀，获得目标产物。所述羟甲基树脂的英文名为Hydroxymethylresin.其中，以羟甲基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，第一个氨基酸采用Fmoc-Tyr-OH，以TBTU为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH的方法包括如下步骤：（1）制备Fmoc-Tyr-树脂：将羟甲基树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干；加入溶解于DMF中的Fmoc-Tyr-OH和DIPEA中，20-40℃反应0.5-1.5小时，加甲醇，20-40℃反应0.5-1.5小时，抽干，分别用DMF、甲醇DMF分别洗涤，抽干，获得Fmoc-Tyr-树脂；（2）制备Fmoc-Val-Tyr-树脂：将上述Fmoc-Tyr树脂中，加入7.5%DBU的DMF溶液，20-35℃反应15-25分钟，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干。加入Fmoc-Val-OH、TBTU溶解于DMF，20-30℃反应1.0-2小时，抽干，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Val-Tyr-树脂；DMF中，树脂的重量浓度为5-15%，Fmoc-Val-OH的摩尔比为树脂的2-5倍，TBTU的摩尔比为树脂的2-5倍。（3）制备Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂：将上述的Fmoc-Val-Tyr-树脂中，加入7.5%DBU的DMF溶液，20-35℃反应15-45分钟，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干。加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH、TBTU溶解于DMF，20-35℃反应1.0-2小时，其余操作同（2），获得Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂；DMF中，Fmoc-Val-Tyr-树脂的重量浓度为5-15%，Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩尔比为树脂的2-5倍，TBTU的摩尔比为树脂的2-5倍。Fmoc-Val-Tyr-树脂与7.5%DBU的DMF溶液的重量比例为：Fmoc-Val-Tyr-树脂∶7.5%DBU的DMF溶液=1∶5-15；（4）制备Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂：将上述Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂中，加入7.5%DBU的DMF溶液，20-35℃反应15-45分钟，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干。加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU溶解于DMF，20-30℃反应1.0-2小时，DMF、甲醇、DMF分别洗涤三次，获得Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂；DMF中，Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂的重量浓度为5-15%，Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔比为树脂的2-5倍，TBTU的摩尔比为树脂的2-5倍。Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂与7.5%DBU的DMF溶液的重量比例为：Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂∶7.5%DBU的DMF溶液=1∶5-15；（5）制备Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂：将上述Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂中，加入7.5%DBU的DMF溶液，20-35℃反应15-45分钟，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干。加入Boc-Arg-OH、TBTU，溶解于DMF，20-35℃反应1.0-2小时，其余操作同（2），获得Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂；DMF中，Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂的重量浓度为5-15%，Boc-Arg-OH的摩尔比为树脂的2-5倍，TBTU的摩尔比为树脂的2-5倍。Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂与7.5%DBU的DMF溶液的重量比例为：Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂∶7.5%DBU的DMF溶液=1∶5-15；所述切肽包括如下步骤：将切肽试剂加入Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂,15-35℃反应1.5-3小时，加入乙酸乙酯沉淀，过滤，收集沉淀物，用乙酸乙酯洗,P2O5真空干燥，得粗品；所述分离纯化包括如下步骤：将粗品溶于醋酸铵的水溶液中，过滤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胸腺五肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以羟甲基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，第一个氨基酸采用Fmoc?Tyr?OH，以TBTU为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc?Arg?OH；切肽，提纯，获得目标产物。

【技术特征摘要】
1.一种胸腺五肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以羟甲基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，第一个氨基酸采用Fmoc-Tyr-OH，以TBTU为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH；（2）将2NHCl/HAc加入步骤（1）的产物进行切肽，加入乙酸乙酯沉淀，过滤、洗涤得五肽粗品；（3）将步骤（2）的粗品采用C18柱进行分离纯化，流动相为2%硫酸铵-甲醇溶液；（4）将上柱收集得到的溶液，减压浓缩至原体积的十分之一，加乙酸乙酯沉淀，获得目标产物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以羟甲基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，第一个氨基酸采用Fmoc-Tyr-OH，以TBTU为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH的方法包括如下步骤：（1）制备Fmoc-Tyr-树脂：将羟甲基树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干；加入溶解于DMF中的Fmoc-Tyr-OH和DIPEA中，20-40℃反应0.5-1.5小时，加甲醇，20-40℃反应0.5-1.5小时，抽干，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Tyr-树脂；（2）制备Fmoc-Val-Tyr-树脂：将上述Fmoc-Tyr-树脂中，加入7.5%DBU的DMF溶液，20-35℃反应15-25分钟，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干；加入Fmoc-Val-OH、TBTU溶解于DMF，20-30℃反应1.0-2小时，抽干，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Val-Tyr-树脂；DMF中，Fmoc-Tyr-树脂的重量浓度为5-15%，Fmoc-Val-OH的摩尔比为树脂的2-5倍，TBTU的摩尔比为树脂的2-5倍；（3）制备Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂：将上述的Fmoc-Val-Tyr-树脂中，加入7.5%DBU的DMF溶液，20-35℃反应15-45分钟，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干；加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH、TBTU溶解于DMF，20-35℃反应1.0-2小时，其余操作同（2），获得Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂；DMF中，Fmoc-Val-Tyr-树脂的重量浓度为5-15%，Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩尔比为树脂的2-5倍，TBTU的摩尔比为树脂的2-5倍；Fmoc-Val-Tyr-树脂与7.5%DBU的DMF溶液的重量比例为：Fmoc-Val-Tyr-树脂∶7.5%DBU的DMF溶液=1∶5-15；（4）制备Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文琪，崔颀，周逸明，
申请(专利权)人：上海苏豪逸明制药有限公司，周逸明，崔颀，
类型：发明
国别省市：