一种制备艾塞那肽的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备艾塞那肽的方法，解决了现有技术存在的成本高，收率低，杂质（des-Glu15,Glu16-艾塞那肽）含量较大，不适合规模化生产的问题。本发明专利技术的具体步骤为：A）以氨基树脂为起始树脂，通过Fmoc固相合成法，按照艾塞那肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中，肽序15-17的氨基酸偶联反应中，溶液DMF中添加其体积20%的2,2,2-三氟乙醇和1.5mol/L的尿素；B）肽树脂裂解后，第一次纯化采用反相填料，第二次纯化采用阴离子树脂，脱盐后可以使杂质des-Glu15,Glu16-艾塞那肽含量降低到0.1%以下，冻干，得到艾塞那肽。本发明专利技术提供了一种成本低、纯度高，适合规模化生产的艾塞那肽的制备工艺，此工艺既能有效控制des-Glu15,Glu16-艾塞那肽含量又不影响艾塞那肽的收率。

【技术实现步骤摘要】
一种制备艾塞那肽的方法
本专利技术涉及一种多肽类药物的制备方法，是一种合成的具有胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂的II型糖尿病的治疗特效药-艾塞那肽的制备方法。
技术介绍
艾塞那肽，英文名：Exenatide，为一直链39肽，结构式如下：肽序列为：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2艾塞那肽是由Amylin公司开发的一支拟肠降血糖素，主要用于治疗II型糖尿病，于2005年4月28号获得美国FDA的批准。艾塞那肽具有GLP-1受体激动剂作用，在分子结构、生物活性、作用靶点及免疫原性等方面与GLP-1相似。艾塞那肽的分子结构与GLP-1的同源性达53％，结构差异表现在：（1）C端多出9个氨基酸（PSSGAPPPS），不易被肽链内切酶降解；（2）N端第二个氨基酸为甘氨酸，不会被二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）分解。特殊的分子结构使本品在血浆中的半衰期长达9.57小时，患者每天注射两次且低血糖发生风险小，当血糖升高时，本品能够升高细胞内cAMP，诱导胰岛素释放；当血糖降低时，其诱导胰岛素释放的作用即会消退。此外，本品还能够以血糖依赖性方式降低胰高血糖素的分泌，并延迟胃排空。现有技术US6902744、US6924264中，艾塞那肽的制备采用固相合成的方法。此种方法由于艾塞那肽是含有39个氨基酸的长肽，存在技术难度大、合成周期长、生产成本高、过程中间体因为不能纯化带来的杂质致使产物纯度不高，不利于大规模生产等问题。CN102942625A专利中报道了通过液相法先将Ser、Thr、Cys衍生化成伪脯氨酸结构，即侧链-羟基或β-巯基与醛或者酮形成类似脯氨酸的噁唑烷五元环结构，然后按照Fmoc固相合成、HPLC纯化后得到艾塞那肽，纯度为95%、收率为36%。这种方法由于先要液相生成相应的假二肽，因此存在合成周期长、生产成本高、不利于大规模生产等问题。现有艾塞那肽的固相合成，由于艾塞那肽合成步骤较多，造成产物杂质种类比较多，包括：des-Glu15,Glu16-艾塞那肽及其它杂质等。其中有关杂质des-Glu15,Glu16-艾塞那肽的氨基酸序列如下：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2该杂质为毒性最大的杂质之一，而且极其不稳定，该杂质的存在严重影响艾塞那肽含量以及使用安全。因此需要找到有效的方法将其去除并使其达到优质标准级别0.1%以下。本专利技术人研究发现，该杂质用现有技术的手段很难除去，有些方法虽可以去除部分，但去除效果不理想，难以达到优质标准级别同时容易造成艾塞那肽本身收率降低。本专利技术人用现有的合成方法，制备艾塞那肽，发现成本高，收率低，杂质多，不适于工业化规模生产。为此，本专利技术人对艾塞那肽的制备方法进行了研究，提供了一种成本低、纯度高，适合规模化生产的艾塞那肽的制备工艺，此工艺既能有效控制des-Glu15,Glu16-艾塞那肽含量又不影响艾塞那肽的收率问题。
技术实现思路
本专利技术涉及一种制备艾塞那肽的方法，解决了现有技术存在的成本高，收率低，杂质des-Glu15,Glu16-艾塞那肽含量较大，不适合规模化生产的问题。本专利技术的目的在于提供一种成本低、纯度高，适合规模化生产的艾塞那肽的制备工艺，此工艺既能有效控制des-Glu15,Glu16-艾塞那肽含量又不影响艾塞那肽的收率问题。本专利技术的合成路线如图1所示：A）首先由氨基树脂和Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联得到Fmoc-Ser(tBu)-树脂，然后通过Fmoc固相合成法，按照艾塞那肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中，肽序15-17的氨基酸偶联反应中，溶液DMF中添加其体积20%的2,2,2-三氟乙醇和1.5mol/L的尿素；B）肽树脂裂解后，第一次纯化采用反相填料，第二次纯化采用阴离子树脂，脱盐后可以使des-Glu15,Glu16-艾塞那肽含量降低到0.1%以下，冻干，得到艾塞那肽。本专利技术中一些常用的缩写具有以下含义；Fmoc：芴甲氧羰基Fmoc-AA-OH：芴甲氧羰基保护的氨基酸DIC：N，N′-二异丙基碳化二亚胺DCC：N，N′-二环己基碳二亚胺PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯HOBt：1-羟基苯骈三唑tBu：叔丁基Trt：三苯甲基Boc：叔丁氧羰基Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基Tyr：酪氨酸Ile：异亮氨酸Gln：谷氨酰胺Asn：天冬酰胺Cys：半胱氨酸Pro：脯氨酸Leu：亮氨酸Gly：甘氨酸Arg：精氨酸Val：缬氨酸Trp：色氨酸Ala：丙氨酸Met：甲硫氨酸Phe：苯丙氨酸Glu：谷氨酸Lys：赖氨酸Ser：丝氨酸Asp：天冬氨酸Thr：苏氨酸His：组氨酸DMF：N，N′-二甲基甲酰胺MeOH：甲醇DCM：二氯甲烷TFE：2,2,2-三氟乙醇NMP：N-甲基吡咯烷酮DMSO：二甲基亚砜TFA：三氟醋酸EDT：乙二硫醇Piperidine：六氢吡啶DIEA：N，N′-二异丙基乙胺为此本专利技术提供一种制备艾塞那肽的方法，其步骤如下：步骤1，以氨基树脂为起始树脂，通过Fmoc固相合成法，按照艾塞那肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中，肽序15-17的氨基酸偶联反应中，溶液DMF中添加其体积20%的2,2,2-三氟乙醇和1.5mol/L的尿素；步骤2，裂解后，第一次纯化采用反相填料，第二次纯化采用阴离子树脂，脱盐后可以使des-Glu15,Glu16-艾塞那肽含量降低到0.1%以下，冻干，得到艾塞那肽。其中，步骤1所述的固相合成方法，1）采用0.10~0.35mmol/g的氨基树脂为起始树脂；2）采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除氨基树脂上的Fmoc保护基；3）在偶联剂系统的存在下，氨基树脂和Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联得到Fmoc-Ser(tBu)-树脂；4）重复步骤2）、3），按照艾塞那肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备艾塞那肽的方法，提供了一种成本低、纯度高，适合规模化生产的艾塞那肽制备工艺，此工艺既能有效控制des‑Glu15,Glu16‑艾塞那肽含量又不影响艾塞那肽的收率问题，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 步骤1，以氨基树脂为起始树脂，通过Fmoc固相合成法，按照艾塞那肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中，肽序15‑17的氨基酸偶联反应中，溶液DMF中添加其体积20 %的2,2,2‑三氟乙醇和1.5 mol/L的尿素；步骤2，肽树脂裂解后，第一次纯化采用反相填料，第二次纯化采用阴离子树脂，脱盐后可以使杂质des‑Glu15,Glu16‑艾塞那肽含量降低到0.1 %以下，冻干，得到艾塞那肽。

【技术特征摘要】
1.一种制备艾塞那肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1，以氨基树脂为起始树脂，通过Fmoc固相合成法，按照艾塞那肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中，肽序15-17的氨基酸偶联反应中，溶液DMF中添加其体积20％的2,2,2-三氟乙醇和1.5mol/L的尿素；步骤2，肽树脂裂解后，1)第一次纯化采用C18柱纯化，纯化条件：流动相为：A相：0.1％TFA；B相：乙腈；梯度程序为：15％B，60min内至60％B；检测波长220nm；收集目的峰馏分；2)第二次纯化采用阴离子树脂，用UniDEAE-10阴离子交换柱；流动相：A为10mmol/L醋酸铵水溶液用稀氨水调节其pH值为7.30±0.20...

【专利技术属性】
技术研发人员：路杨，杨东晖，陈晓航，周亮，
申请(专利权)人：杭州诺泰制药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33