本发明专利技术涉及基因工程及发酵工程领域，具体地，本发明专利技术涉及一种脂肪酶EALIP及其基因和应用。本发明专利技术提供了一种脂肪酶EALIP，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，且本发明专利技术还提供了编码上述脂肪酶的基因EGALip，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，本发明专利技术还提供了包含上述基因的重组载体、重组菌株及其应用。本发明专利技术的脂肪酶生产菌种通过高密度液体发酵后能够达到较高的发酵水平，可广泛应用于食品、饲料、油脂加工、医药等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程及发酵工程领域，具体地，本专利技术涉及一种脂肪酶EALIP及 其基因和应用。
技术介绍
脂肪酶（Lipase，EC 3. 1. 1. 3)又称为甘油三酯水解酶，能催化天然底物油脂水解 生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，被广泛应用于食品、饲料、油脂加工、医药、洗涤等工 业，是一种重要的工业酶制剂，具有十分广阔的应用前景。 不同来源的脂肪酶的氨基酸顺序和分子大小差别很大，但都是以相同的方式进行 折叠的，即α/β折叠。这种结构包含一个被α螺旋包围着的以平行β-片层结构为主的 核，折叠片之间通过α螺旋相连接。 脂肪酶作为一种重要的工业用酶制剂，其应用主要表现在以下几个方面： 1、食品工业 脂肪酶在食品工业中的应用主要包括： (1)用于脂肪或油脂的加工，改变其物理、化学性状或提高其营养价值。 (2)改善食品风味或品质，延长面包、糕点等产品的保质期，控制非酶褐变，增大面 包等产品的体积等。 2、饲料工业 脂肪酶作为一种饲用酶制剂，可以有效地提高猪、鸡、鸭、鱼等在生长过程中对脂 肪的吸收和利用，提高动物饲粮中能量的利用率，同时还可补充部分必需的营养物质。 3、日化洗涤行业 在洗涤剂中加入5_500U/g的脂肪酶，能提高洗涤剂的去污能力并降低表面活性 剂和三聚磷酸钠的用量，减少去污剂对环境的污染。另外，在废水处理时加入一定量的脂肪 酶，可高效除去脂肪，减少废水处理的成本和降低二次污染。 此外，脂肪酶还可应用于造纸、医药、环保等行业。 脂肪酶广泛存在于动植物和微生物中，植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种 子，动物体内含脂肪酶较多的则是胰脏和脂肪组织。能产脂肪酶的微生物很多，主要集中在 黑曲霉、假丝酵母、根霉、假单胞菌、链霉菌等菌株。 由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，而且具有比动物更广泛的pH值、温 度范围以及底物专一性，因此微生物脂肪酶成为工业用脂肪酶的重要来源。 目前国内脂肪酶的生产仍然面临着发酵水平低、应用效果不强、生产成本高等问 题，因此大力加大脂肪酶的研发力度，尽快推出合适的脂肪酶产品，成为我国酶制剂行业的 一个亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种脂肪酶EALIP。 本专利技术的另一目的是提供编码上述脂肪酶的基因 EGALip。 本专利技术的另一目的是提供包含上述脂肪酶的重组载体EGALip-pPICZaA。 本专利技术的另一目的是提供包含上述脂肪酶基因 EGALip的重组菌株。 本专利技术的另一目的是提供制备上述脂肪酶EALIP的方法。 本专利技术的另一目的是提供上述脂肪酶EALIP的应用。 本专利技术所提供的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示： 该脂肪酶酶蛋白由291个氨基酸组成，其N端前20个氨基酸序列为信号肽序列， 理论pI/Mw :4. 92/30972,成熟的脂肪酶EALIP序列如下SEQ ID No. 2所示： 本专利技术还提供了编码上述脂肪酶的基因 EGALip，该基因的序列如SEQ ID No. 3所 示： 整个基因序列为876bp，其中l-60bp为信号肽序列，成熟蛋白的编码序列如SEQ ID No. 4 所示。 本专利技术的脂肪酶的最适反应温度为50°C，最适反应pH为6. 0,该脂肪酶在75°C前 耐热性能良好，当处理温度超过75°C后，酶活有一定程度的损失，Ca2+、Mg2+、C 〇2+对酶活有一 定的激活作用，K+、Zn2+、Fe2+、Mn2+对酶活影响不大，Fe 3+、Cu2+则对酶活有一定程度的抑制作 用。 本专利技术还提供了包含上述脂肪酶基因 EGALip的重组载体，优选为 EGALip-pPICZaA。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选为将本专利技术的脂肪酶基因 EGALip插入到质粒pPICZaA上的EcoR I和Notl限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位 于A0X1启动子的下游并受其调控，获得重组酵母表达载体EGALip-pPICZaA。 本专利技术还提供了包含上述脂肪酶基因 EGALip的重组菌株，优选重组菌株为毕赤 酵母菌株X33。 本专利技术还提供了一种高效表达上述脂肪酶基因 EGALip的方法，具体包括以下步 骤： 1)用上述重组载体采用电转化法转化毕赤酵母感受态细胞X33,筛选获得重组菌 株 EGALip-pPICZaA - X33 ; 2)采用筛选获得的重组毕赤酵母菌株在25L发酵罐中进行发酵，诱导该脂肪酶的 表达；以及 3)发酵结束后，回收并纯化所表达的该脂肪酶进行相关测试。 其中，重组菌株在发酵罐中的发酵过程可分为3个阶段： 第一阶段为菌体培养阶段，按10%的比例接入种子，培养16-20小时，以补完葡萄 糖、pH及D0上升为标志； 第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以 上即表明该阶段结束，为期约30-60min ; 第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20%以上，整个培养 时间为180-200小时之间。 发酵结束后，发酵液可通过陶瓷膜去除菌体及超滤膜处理后获得浓缩的粗酶液。 利用本专利技术的方法高效表达上述的脂肪酶，可达到15000U/mL左右的发酵水平，而且酶的 稳定性能好，大大降低了脂肪酶的生产成本，有利于该脂肪酶的推广应用。【附图说明】 图1、重组脂肪酶在25L罐中的发酵过程曲线 图2、重组脂肪酶的最适反应温度曲线 图3、重组脂肪酶的最适反应pH曲线 图4、重组脂肪酶的耐温性能曲线 图5、重组脂肪酶在室温下保存稳定性的测定结果 图6、各种离子对脂肪酶酶活力的影响【具体实施方式】 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行； 所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 实验材料和试剂： 1、菌株与载体 大肠杆菌菌株ToplO、毕赤酵母X33、载体pPICZaA均购自Invitrogen公司。 2、酶与试剂盒 逆转录酶Superscript? III购自Invitrogen公司。RNA提取试剂盒、质粒DNA提 取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、连接酶、限制性内切酶购自上海生工公司。 3、培养基 基础盐培养基（BSM):磷酸二氢铵5 %、磷酸二氢钾0. 5 %、七水硫酸镁1. 5 %、硫酸 钾1. 95%、硫酸钙0. 1%、氢氧化钾0. 1%、消泡剂0. 03%。0. lMPa、121°C灭菌30min，冷却 后每升加4. 4毫升无当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来源于黑曲霉的脂肪酶EALIP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张慧君，王俊峰，林海晶，张鹏鹏，
申请(专利权)人：江苏奕农生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。