本发明专利技术涉及沙雷氏菌脂肪酶(SmL)分子改造所得的突变体、其基因和氨基酸序列，含有该突变体基因的重组表达质粒及重组表达转化子，重组酶制剂的制备方法，以及该酶制剂在地尔硫卓前体合成中的应用。与野生型沙雷氏菌脂肪酶相比，本发明专利技术的突变体活性显著提高，并保持了优异的立体选择性，在心血管病药物地尔硫卓的关键手性前体(–)‑对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的工业生产中具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种沙雷氏菌脂肪酶的突变体、表达该突变体的重组表达质粒及重组表达转化子、该脂肪酶突变体酶制剂的制备方法，以及该突变体酶制剂在酶法拆分制备(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯中的应用。
技术介绍
地尔硫卓是一个高选择性的钙通道阻滞剂，可以抑制钙离子通过血管平滑肌和心肌细胞膜通道的运转，具有使心肌细胞激动—收缩解偶联和强效的扩张血管的作用。该药具有良好的疗效，并且毒副作用小，广泛应用于心绞痛和高血压的长期治疗。采用化学—酶法合成地尔硫卓可以简化合成路线、提高收率、降低成本，该法已广泛应用于工业化生产。在该工艺中，一般采用脂肪酶选择性拆分(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯[(±)-MPGM]获得关键的单一构型手性中间体(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。地尔硫卓的化学-酶法生产工艺于上世纪首先在日本投产，田辺公司使用的专利菌株为S.marcescensSr418000，他们将该菌株的胞外脂肪酶LipA固定在膜反应器中用于拆分消旋体，制备(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，产量为40kg(-)-MPGM/m2/年。本实验室以(±)-MPGM为底物，从100多株不同微生物菌株中筛选到一株粘质沙雷氏菌(S.marcescens)ECU1010(中国专利ZL200410067046.1，保藏号CGMCC1219)，该菌株其所产胞外脂肪酶能高度立体选择性水解拆分(±)-MPGM得到(2R,3S)-(-)-MPGM(E>100)。利用PCR方法克隆了粘质沙雷氏菌CGMCC1219胞外脂肪酶SmL基因。该基因全长1845bp，编码614个氨基酸，与基因数据库中其它的粘质沙雷氏菌脂肪酶基因相比，在DNA水平有94％～96％的同源性，在氨基酸水平有96％～98％的同源性。利用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌株、pET-24a(+)作为表达载体，实现了该脂肪酶基因的表达。沙雷氏菌脂肪酶的应用中，由于酶的活性较低，因此酶用量大，导致反应液乳化严重，产物分离困难。因此有必要通过蛋白质工程改造，提高沙雷氏脂肪酶的活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，通过蛋白质工程对沙雷氏菌脂肪酶SmL进行改造，得到活性提高的突变体，用于拆分(±)-对甲氧苯基缩水甘油酯，制备地尔硫卓合成的关键手性前体(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。与野生型沙雷氏菌脂肪酶SmL相比，通过蛋白质工程改造得到的突变体的催化效率显著提高，从而可以减少酶蛋白的用量。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：技术方案之一：活性提高的沙雷氏菌脂肪酶突变体的获得本专利技术所述的野生型沙雷氏菌脂肪酶SmL来源于沙雷氏菌ECU1010，该菌株已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC1219，已在中国专利ZL200410067046.1中公开。所述脂肪酶SmL的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。基于已报道的沙雷氏菌脂肪酶SmL的结构，选择底物结合口袋周围的氨基酸位点，进行饱和突变，通过大量的筛选和验证，发现在SEQIDNo.2所示氨基酸序列的基础上对第315位的亮氨酸残基、第271位的丝氨酸残基和第311位的色氨酸残基进行单点替换后，具有较高的脂肪酶活性，在此基础上，通过饱和突变获得活性有显著提高的突变体。较佳地，SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第315位的亮氨酸残基替换为丝氨酸得到的蛋白质(命名为SmLL315S)，第271位的丝氨酸残基替换为苯丙氨酸得到的蛋白质(命名为SmLS271F)，第311位的色氨酸残基替换为甲硫氨酸得到的蛋白质(命名为SmLW311M)。相对于母本，这三个突变体活性提高较为显著。在此基础上，对所获得的单点突变体进行了组合，获得了活性进一步提高的组合突变体，也就是以下四种蛋白质：(1)SEQIDNo.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时271位丝氨酸替换为苯丙氨酸，命名为SmLS271F/L315S；或，(2)SEQIDNo.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸，命名为SmLW311M/L315S；或，(3)SEQIDNo.2所示氨基酸序列的271位丝氨酸替换为苯丙氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸，命名为SmLS271F/W311M；或，(4)SEQIDNo.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时271位丝氨酸替换为苯丙氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸，命名为SmLS271F/W311M/L315S。其中所述脂肪酶的活性测定采用比色法进行测定。在3mL比色皿中加入2.87mL磷酸钾缓冲液(KPB,100mM,pH7.0)，加入100μL适当浓度的酶液，在30℃预保温3min后，然后加入30μL对硝基苯酚丁酸酯溶液(100mM，溶解于DMSO中)，于30℃、405nm读取水解产物对硝基苯酚的吸光度增长速率。在上述反应条件下，每分钟生成1.0μmol对硝基苯酚所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。技术方案之二：一种分离的核酸，所述核酸编码如技术方案一所述沙雷氏菌脂肪酶突变体本专利技术所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，通过基因克隆技术获得编码沙雷氏菌脂肪酶SmL突变体的核酸分子，或通过人工全序列合成的方法得到编码沙雷氏菌脂肪酶SmL突变体的核酸分子。技术方案之三：一种包含上述核酸的重组表达质粒可通过本领域常规方法将本专利技术的沙雷氏菌脂肪酶SmL突变体核酸序列连接到合适的载体上构建而成，优选载体为质粒pET28a。较佳地，可由以下操作获得上述重组表达质粒：将PCR扩增得到的核酸产物和质粒pET28a用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，回收酶切产物，经T4连接酶连接得到重组表达质粒。技术方案之四：一种包含上述重组表达质粒的重组表达转化子可通过将本专利技术的重组表达质粒转化至宿主细胞中来构建所述重组表达转化子，所转化述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主微生物，前提是能使所述重组表达质粒可以复制，且其所携带脂肪酶SmL突变体基因可被有效表达。本专利技术优选宿主细胞为大肠杆菌，更优选地为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α。技术方案之五：一种沙雷氏菌脂肪酶突变体酶制剂的制备方法一种沙雷氏菌脂肪酶突变体酶制剂的制备方法，所述酶制剂可以是下列形式中的任意一种：(1)培养如权利要求6所述的重组表达转化子，离心得到重组表达转化子细胞；或，(2)对获得的重组表达转化子细胞进行破碎，分离得到含有如权利要求1-3中任一项所述重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的粗酶液；或，(3)对粗酶液进一步纯化得到的重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的纯酶。所述重组表达转化子的培养条件为本领域常规的方法和条件，可以根据宿主类型选择适当的条件，只要可以使重组表达转化子生长并且生产所述沙雷氏菌脂肪酶突变体即可。其中所述沙雷氏菌脂肪酶突变体酶制剂制备方法较佳地为：将如技术方案四所述重组表达沙雷氏菌脂肪酶突变体的重组大肠杆菌，接种至含50μg/mL硫酸卡那霉素的培养基(蛋白胨5～10g/L，酵母膏2～5g/L，NaCl5～10g/L，pH7.0)中，30～40℃，160～200rpm振荡培养至OD600为1.0～3.0。按0.8～2％(v/v)的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种活性提高的沙雷氏菌脂肪酶突变体，其特征在于，其是对如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第271位、第311位、第315位氨基酸经过一个或多个氨基酸替换后形成的新氨基酸序列构成的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种活性提高的沙雷氏菌脂肪酶突变体，其特征在于，其是对如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第271位、第311位、第315位氨基酸经过一个或多个氨基酸替换后形成的新氨基酸序列构成的蛋白质。2.根据权利要求1所述的一种沙雷氏菌脂肪酶突变体，其特征在于，其是对如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第271位、第311位、第315位氨基酸经过一个氨基酸替换后形成的新氨基酸序列的蛋白质，具有如下序列：(1)SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第271位丝氨酸替换为苯丙氨酸；或，(2)SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第311位色氨酸替换为甲硫氨酸；或，(3)SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第315位亮氨酸替换为丝氨酸。3.根据权利要求1所述的一种沙雷氏菌脂肪酶突变体，其特征在于，其是对如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第271位、第311位、第315位氨基酸经过多个氨基酸替换后形成的新氨基酸序列的蛋白质，具有如下序列：(1)SEQIDNo.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时271位丝氨酸替换为苯丙氨酸；或，(2)SEQIDNo.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸；或，(3)SEQIDNo.2所示氨基酸序列的271位丝氨酸替换为苯丙氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸；或，(4)SEQ...
【专利技术属性】
技术研发人员：许建和，陈科材，李春秀，陈琦，潘江，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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