一种类辅脂酶2基因的干扰片段及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种类辅脂酶2（colipase-like2，Clpsl2）的干扰片段及其应用，属于生物技术与医药领域。本发明专利技术检测了Clpsl2mRNA和蛋白在附睾中的表达定位，发现Clpsl2在附睾头部上皮细胞中合成，并分泌到管腔，与附睾管腔中的精子头部的顶体和精子尾部的主段特异结合。公开了Clpsl2的干扰片段，其核苷酸序列为：5′-ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT-3′，在小鼠附睾中通过该干扰片段敲低Clpsl2表达后小鼠附睾尾部的精子数量减少、精子运动力减弱，且与雌鼠交配后孕鼠的胚胎数减少，且多个胚胎发育不正常，在雄性小鼠避孕药制备及在小鼠精子成熟相关药物制备中应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种类辅脂酶2（colipase-like2，Clpsl2）的干扰片段及其应用，属于生物技术与医药领域。本专利技术检测了Clpsl2mRNA和蛋白在附睾中的表达定位，发现Clpsl2在附睾头部上皮细胞中合成，并分泌到管腔，与附睾管腔中的精子头部的顶体和精子尾部的主段特异结合。公开了Clpsl2的干扰片段，其核苷酸序列为：5′-ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT-3′，在小鼠附睾中通过该干扰片段敲低Clpsl2表达后小鼠附睾尾部的精子数量减少、精子运动力减弱，且与雌鼠交配后孕鼠的胚胎数减少，且多个胚胎发育不正常，在雄性小鼠避孕药制备及在小鼠精子成熟相关药物制备中应用。【专利说明】一种类辅脂酶2基因的干扰片段及其应用
本专利技术属于生物技术与医药领域，特别涉及一种类辅脂酶2 (colipase-like2,Clpsl2)基因的干扰片段及其应用。
技术介绍
近几年对人类的调查发现，男性精液质量和生殖力在逐步下降。据统计，在中国育龄夫妇中不孕不育的发病率为10-15%，其中男性因素占40%左右。临床发现很多不孕不育病例与精子数量、密度、成熟(运动、获能、顶体反应等)异常相关。另一方面，长期以来，避孕主要是针对育龄妇女，随着国际人权条约的签署，社会对男性避孕提出了倡导和要求，开发自主产权的男性避孕药有利于中国在避孕药市场上提高国际竞争力。附睾是男性生殖器官中的重要环节之一，是精子储存、运输、成熟的关键场所。精子运动能力的形成、顶体功能的完善、代谢类型的转变、精卵的识别和融合等一系列程序化成熟功能的获得都是在附睾微环境中完成的。附睾中特异表达的蛋白将有助于解决精子成熟异常引起的不育、不孕症。同时由于附睾功能相对单一，干扰其功能的药物不至于引起严重的副反应；其次，精子进入附睾前，分化已经完全，DNA复制及转录均停止，在这个阶段药物作用不会引起DNA遗传病，因此附睾也是一个理想的避孕靶器官，而仅在附睾中表达的特异蛋白也成为男性避孕药开发的理想靶点。本专利技术所涉及的Clpsl2为一个功能未知的附睾特异表达的基因，其mRNA主要在附睾头部组织表达，且具有雄激素依赖性和时间特异性。目前仅有两篇文章略略提及Clpsl2，其一为oh等(2006) 在对40个附睾特异表达基因的mRNA表达特性进行分析时包含这个基因(Mm.99400);中科院生化所张永莲院士(2008)通过建库分析人的附睾特异表达基因也发现了这个基因(con32)在附睾头部和体部表达。在前期我们通过原核表达制备了小鼠Clpsl2包涵体蛋白作为抗原免疫家兔制备了多克隆抗血清，也通过融合表达系统制备了 Clpsl2的蛋白初步分析了其辅脂酶活性。但是目前对Clpsl2的表达定位及在附睾体内参与的生物学功能都不清楚，因此也限制了其开发使用。虽然对附睾特异的Clpsl2的相关工作没有开展，但是已经有部分实验室已经开始探索附睾中特异表达的基因及蛋白的功能，在国际上享有盛名的就包括中科院生化所张永莲院士团队。他们对一系列的附睾特异表达基因的特性及功能进行了初步研究，如研究发现LCN6表达于附睾起始部位的大部分的主细胞，与精子的顶体及中段结合，参与了精子运动能力的获得(史毅，大鼠附睾特异性基因Lcn6的表达特性和功能研究，中国科学院研究生院上海生命科学研究院博士学位论文，2007)。同时也对部分附睾特异功能基因及蛋白申请了专利用于保护其所发现的附睾特异基因或者蛋白在精子成熟中的功能(CN1689640)或者保护制备调控雄性生育能力用的药物中、开发男性避孕药及制备诊断和治疗雄性不育症的药物中的用途(专利申请号201010129861)。但目前虽然已对附睾中特异表达的部分基因及蛋白的功能解析，但用于雄性精液原因引起的不孕不育的诊断和治疗，或者作为雄性避孕药物设计的靶点开发相应的药物都还处于设计阶段。
技术实现思路
为克服上述现有技术的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种类辅脂酶2(colipase_like2, Clpsl2)基因的干扰片段。本专利技术的另一目的在于提供上述类辅脂酶2基因的干扰片段的用途。本专利技术的目的通过下述的技术方案实现:一种类辅脂酶2 (Clpsl2)基因的干扰片段，其核苷酸序列为:RNA1-Nol:5' -ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT-3'。所述的类辅脂酶2 (Clpsl2)基因的干扰片段，能够引起小鼠精子数量减少、精子的运动性能减弱和精子活性的降低，在雄性小鼠避孕药制备及在小鼠精子成熟相关药物制备中应用。【专利附图】【附图说明】图1为Clpsl2mRNA在附睾组织中的原位杂交表达定位分析图；Clpsl2蛋白在附睾头部特异的表达，在附睾体、附睾尾及睾丸中无表达；途中深黑色表示Clpsl2的阳性表达信号。图2为Clpsl2蛋白在附睾组织区段性蛋白印迹检测分析图；Clpsl2蛋白在附睾头部特异的表达，在附睾体、附睾尾及睾丸中无表达。图3为Clpsl2蛋白在附睾组织切片中的免疫组化分析图；上图为Clpsl2在整个附睾中的表达分布，且对应的A-D分别表示，A附睾头近侧端；B，附睾头远侧端；C附睾体，D附睾尾，E为附睾头部近侧端(A)局部放大图，F为阴性血清对照，箭头标示Clpsl2阳性表达部位。图4为Clpsl2蛋白在附睾管腔区段浓度梯度分布的间接免疫荧光分析图；上图是附睾示意图，A-H标示所拍摄的附睾组织的部位，A'、E'、G'和H'表示对应部位的阴性血清对照，Clpsl2用Cy3红色荧光标记，图中管腔中高亮信号为Clpsl2表达信号；而细胞核用DAPI染色，图中管壁细胞可见DAPI信号。图5为Clpsl2蛋白与附睾管腔精子结合的间接免疫荧光分析图；Clpsl2用Cy3红色荧光标记，而细胞核用DAPI染色，可见Clpsl2在附睾头和附睾体的精子的头部顶体和尾部主段结合，附睾尾的精子与Clpsl2较附睾头/体部位弱且少。图6为慢病毒介导的RNAi敲低小鼠附睾中Clpsl2表达的蛋白印迹检测图；Clpsl2的表达用抗Clpsl2的抗血清进行检测，GAPDH为内参对照。图7为慢病毒介导的RNAi敲低小鼠附睾中Clpsl2表达后的与雌鼠合笼后的胚胎检测图；敲低Clpsl2表达后，7天后与雌鼠交配，合笼后14天观察胚胎变化，RNA1-N0.1靶标包装的慢病毒敲低Clpsl2表达后,胚胎数量减少,有多个不正常的胚胎；RNA1-N0.2革巴标包装的慢病毒敲低Clpsl2表达后胚胎数量没有明显差别，但胚胎发育迟缓。【具体实施方式】下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。本专利技术所选择的KM小鼠购买于广东省实验动物中心，许可证号SCXK (粤)2008-0002。上述本专利技术采用的慢病毒由上海吉玛制药技术有限公司包装。实施例1:原位杂交检测Clpsl2mRNA在附睾组织中的表达定位用ApaI将含有Clpsl2基因的pGEM-T-Clpsl2载体(关艺青，禹艳红，黄丹，潘善培.小鼠附睾特异性辅脂酶的原核表达及其抗体的制备.暨南大学学报(自然科学与医学版)，2010，31 (2): 105-110.)质粒线性化，酚氯仿纯化后用Roche的地高辛探针标记试剂盒，通过SP6RNA聚合酶标记反义探针，以T7R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种类辅脂酶2基因的干扰片段，其特征在于核苷酸序列为：5′?ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT?3′。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：禹艳红，陈雷，曹佐武，蔡冬青，廉滋珍，秦俊文，齐绪峰，武征，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：