一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法技术

本发明专利技术公开了一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法，属于酶工程技术领域。本发明专利技术通过脂肪酶体外重塑过程中添加不同的调节因子，获得具有高酯化活性的重构脂肪酶，以满足脂肪酶非水相催化的需要。将不具有酯化活性或者活性较低的各种微生物脂肪酶，包括大肠杆菌工程菌外源表达的脂肪酶以及商品脂肪酶，经8M尿素变性处理，在复性过程中添加从华根霉细胞提取的膜环境复合物WTS，可获得酯化活性显著提高的活性重塑脂肪酶，同时脂肪酶常见的水解活性也发生变化。酯化活性的恢复使脂肪酶更适合工业化应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法，属于酶工程

技术介绍
脂肪酶(EC3.1.1.3)，即三酰甘油酯水解酶，是一种广泛存在于动物、植物和多种微生物中的生物催化剂，最早发现于1901年，其主要催化功能在于可以在水-脂界面水解长链三脂酰甘油酯。脂肪酶之所以在生物催化中倍受关注，除了其具有催化化合物酯键水解的能力外，还由于脂肪酶在非水相中可以催化反向的酯化反应和转酯化反应，因而在生物化工领域受到广泛的重视。脂肪酶能够进行非常特殊的化学转化(生物转化)使得它们在食品，洗涤剂，化妆品，有机合成和制药工业中日益流行。例如加工食品，治理废水，生物表面活性剂的合成，处理木材纤维素纸浆纸树脂，手性药物的生物合成等。此外，脂肪酶还具有稳定性佳，转化效率高等优点，在芳香酯、生物柴油、手性化合物的生产中具有良好的应用价值。虽然脂肪酶都具有催化各种化合物酯键水解的能力，但是能够催化非水相酯化反应的脂肪酶种类却非常有限，绝大部分微生物脂肪酶都不表现出明显的催化非水相酯合成的能力。有些脂肪酶在异源表达之后也只表现出显著的水解活性，相对于其野生型的脂肪酶严重丧失了催化酯类合成的能力。这一现象严重制约了脂肪酶在工业生产中的应用。一些蛋白质修饰技术可以用来调节和提高酶的活性，如有机溶剂修饰、固定化技术等，但这些技术往往无法从本质上改变脂肪酶的催化性能。蛋白质的变性复性技术也可以调整蛋白质的活性，主要应用于包涵体的复性。许多真菌蛋白在细菌中无法表达或以无活性的包涵体形式存在。通常使用高浓度的还原剂使包涵体进行可逆变性，通过稀释或透析降低还原剂的浓度，从而使蛋白在低浓度或无还原剂的情况下重新折叠形成可溶的蛋白溶液。也有学者通过在包涵体的复性过程中加入有机溶剂、表面活性剂等促进包涵体的溶解。然而大部分包涵体经过变复性处理后，仍旧达不到理想的活性，通过变性复性处理通常更不会使得蛋白质催化活性发生转变或得到其他活性重塑。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术通过添加膜环境复合物，为变性的脂肪酶蛋白肽链提供一个类似膜的模拟疏水环境，在缓慢复性的过程当中使脂肪酶重新折叠形成适当的高级构象，从而实现催化酯化反应能力的恢复，对于其他脂肪酶的改造和制备也提供了有价值的方案。本专利技术提供了一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法，利用添加环境因子的结构重塑方法获得具有高酯化活性的脂肪酶。本专利技术采用体外重折叠的方法对脂肪酶进行处理，获得了具有催化酯合成能力的脂肪酶，解决了许多脂肪酶不表现酯化活性以及脂肪酶在工程菌异源表达后丧失酯合成能力的问题，为拓宽脂肪酶的工业应用奠定了基础。所述活性重塑方法，是对脂肪酶进行变性和复性处理，在变性或者复性的过程中添加膜环境复合物，模拟天然细胞环境，使复性的脂肪酶重新恢复合成酯的能力，获得高的酯合成活性。在本专利技术的一种实施方式中，所述脂肪酶为外源表达的华根霉成熟肽脂肪酶(包括包涵体)、华根霉脂肪酶r27RCL、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LipozymeTL1M、洋葱假单胞菌脂肪酶62309或南极假丝酵母脂肪酶CALB。在本专利技术的一种实施方式中，所述变性处理是采用常规的变性方法对脂肪酶进行处理。在本专利技术的一种实施方式中，所述变性处理，可以是用高浓度尿素、盐酸胍等变性剂处理，溶解脂肪酶蛋白样品。在本专利技术的一种实施方式中，所述变性处理具体是：在脂肪酶的蛋白溶液中缓慢加入尿素粉末，低温下搅拌，测定水解活性，活性完全丧失即判断三级结构完全打开形成肽链，蛋白全部变性；离心取上清。在本专利技术的一种实施方式中，所述变性处理后的蛋白，调整至蛋白浓度不高于2.5mg·mL-1，以保证蛋白能够完全的进行复性。在本专利技术的一种实施方式中，所述膜环境复合物是指来自华根霉菌体细胞的膜环境复合物。在本专利技术的一种实施方式中，所述华根霉是以下任意一种或者多种：华根霉CCTCCM201021、CCTCCAF93141、CCTCCAF93158、CICC3091、CICC40720(均为已公开或可购买得到的菌株，不需要提交保藏证明)。在本专利技术的一种实施方式中，所述膜环境复合物的提取，是先从培养好的华根霉菌体上利用TritonX-100、CHAPS、Tween80、脱氧胆酸等表面活性剂提取膜环境复合物及膜结合蛋白，然后通过吸附提取液中的表面活性剂使膜结合蛋白沉淀，经离心分离后所得上清液即为膜环境复合物。在本专利技术的一种实施方式中，所述吸附是使用美国bio-rad伯乐公司Bio-BeadsSM-2吸附剂吸附去除表面活性剂。在本专利技术的一种实施方式中，所述膜环境复合物的提取，具体是：(1)利用华根霉菌体经丙酮洗涤制备丙酮粉；(2)将丙酮粉悬浮于磷酸缓冲液中，搅拌、离心、取沉淀、洗涤两次以上，然后将洗涤后的沉淀重新悬浮于含有0.05-0.15％TritonX-100的磷酸缓冲液中，搅拌、离心，将得到的沉淀悬浮于1-2％TritonX-100磷酸缓冲液中，振荡4-12小时、离心，得到的上清液为膜环境复合物及膜结合蛋白；(3)在提取液中加入吸附剂Bio-beads，振荡、离心，所得上清液即为膜环境复合物WTS。在本专利技术的一种实施方式中，所述野生型膜结合脂肪酶RCL提取过程中悬浮或者重悬，是将固体(比如丙酮粉或者沉淀)按照m/v为1:8-1:12的比例。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷酸缓冲液为2.5mmol·L-1pH6.2磷酸缓冲液。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)或步骤(2)的搅拌、离心，是用磁力搅拌3-10min、在8000-12000r·min-1离心12-18min。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)或(3)中的振荡、离心，是在4℃温和振荡4-12h、于12000-15000r·min-1下离心15-30min。在本专利技术的一种实施方式中，所述膜环境复合物短期内4℃储存备用。在本专利技术的一种实施方式中，所述复性是将变性处理得到的蛋白溶液与膜环境复合物混合，然后装入透析袋中进行透析复性。在本专利技术的一种实施方式中，所述蛋白溶液与膜环境复合物是按照体积比1:1混合。在本专利技术的一种实施方式中，所述透析复性，是透析袋经6M-4M-2M-0M尿素-PBS透析液梯度透析，使蛋白充分复性。在本专利技术的一种实施方式中，所述透析复性，具体是：先放置于6M尿素的磷酸缓冲液中，待透析袋内外盐平衡之后，将透析液更换为4M尿素的磷酸缓冲液，然后更换为2M尿素的磷酸缓冲液，再更换为不含尿素的磷酸缓冲液，透析结束后取出复性蛋白，离心得上清液即为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法，其特征在于，所述方法是对脂肪酶进行变性和复性处理，在变性或者复性的过程中添加膜环境复合物。

【技术特征摘要】
1.一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法，其特征在于，所述方法是对脂肪酶进行变
性和复性处理，在变性或者复性的过程中添加膜环境复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述膜环境复合物是来自华根霉菌体细胞
的膜环境复合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性重塑方法，在变性或者复性时单
独添加膜环境复合物，或者同时添加膜环境复合物和表面活性剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性重塑是指脂肪酶催化酯化反应的
活性重塑。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述同时添加膜环境复合物和表面活性剂
中的表面活性剂为以下任意一种或者两种以上：两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂、
CTAB阳离子表面活性剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶为外源表达的华根霉成熟肽脂
肪酶(包括包涵体)、华根霉脂肪酶r27RCL、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LipozymeTL1M、
洋葱假单胞菌脂肪酶62309或南极假丝酵母脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：王栋，徐岩，张璋，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32