本发明专利技术涉及一种以脂肪酶活为指标快速筛选泰乐菌素高效价菌株及培养基的方法，该筛选方法是在以植物油为主要碳源的分离平板培养基中加入罗丹明B，然后涂布弗氏链霉菌孢子悬浮液进行平板培养，培养结束后挑选菌落水解圈直径与菌落直径比大的单菌落，将该单菌落一部分接斜面，另一部分接摇瓶培养基考察效价。本发明专利技术在培养基中添加罗丹明B（RhodamineB），使水解圈呈现出粉红色，根据菌落水解圈的直径与菌落直径比值，挑选符合要求的优良菌株，减少了工作量，提高了筛选效率，增加选中高产菌株的几率。同理，本发明专利技术利用弗氏链霉菌在不同氮源条件下的脂肪酶活为指标可选择出适合于其生长的培养基配方，从而提高发酵效价。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物发酵
，特别是涉及。
技术介绍
泰乐菌素(Tylosin)是一种禽畜专用的大环内酯类抗生素，是Mocuire于1955年在弗氏链霉菌kStreptomyces fradiae)的培养液中发现的。泰乐菌素对革兰氏阳性菌及某些阴性菌(如金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎双球菌、化脓棒状杆菌等)有效，对螺旋体与支原体有特效。它不仅对鸡的败血症、猪的流行性肺炎和赤病及小牛支原体引起的肺炎有独特的疗效，而且对畜、禽的生长还有明显的促进作用，所以被广泛的应用于畜禽生产及兽医治疗，从而导致国际国内市场需求量极大。现有技术中，弗氏链霉菌的菌种选育过程为:将孢子悬浮液涂布在分离平板上进行培养，之后根据经验以菌落的大小，形态，颜色为单纯的指标选育优良菌株，然后再经过斜面和摇瓶考察最终确定优良菌株。这种筛选方式往往导致许多优良的菌株在筛选过程中被忽略掉；另外，在筛选过程中由于发酵周期长给菌种的选育及培养基的优化带来困难。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服上述上述现有技术缺陷，提供一种有效增加高产菌株的筛选机率，提高菌种筛选效率，降低工作量的以脂肪酶活为指标快速筛选泰乐菌素高效价菌株的方法。本专利技术的另一目的是提供一种以脂肪酶活为指标快速筛选泰乐菌素培养基的方法。为实现上述专利技术目的所采取的技术方案为:一种以脂肪酶活为指标快速筛选泰乐菌素高效价菌株的方法，其特征是:在以植物油为主要碳源的分离平板培养基中加入罗丹明B，然后涂布弗氏链霉菌孢子悬浮液进行平板培养，培养结束后挑选菌落水解圈直径与菌落直径比大的单菌落，将该单菌落一部分接斜面，另一部分接摇瓶培养基考察效价。所述罗丹明B的用量为每1000ml分离平板培养基中加入5~10ml。所述分离平板培养基的组成为:玉米淀粉18g，植物油5~10g，硝酸铵lg，磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，七水硫酸锌0.01g, Rhodamine B 5~10mL,琼脂30g，无盐水加至1000mL，灭菌前pH调到?.2。所述植物油为豆油、菜籽油或玉米油。一种以脂肪酶活为指标快速筛选泰乐菌素培养基的方法，其特征是:在不同氮源的条件下测定泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌代谢植物油时的脂肪酶活力的变化，并以第一天的脂肪酶活力为指标，筛选出高脂肪酶活力的培养基。所述不同氮源条件下的摇瓶发酵培养基的组成为:有机氮源10g，玉米淀粉20g，植物油30g,甜菜碱1.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镍0.0044g,硫酸镁0.lg,氯化钠1.lg,氯化钾1.lg，轻质碳酸钙2.2g，无盐水加至lOOOmL，pH7.2 ；所述有机氮源为棉籽饼粉、鱼粉、玉米蛋白粉、玉米浆、酵母粉、菜籽饼粉和蚕蛹粉中的一种或几种。在泰乐菌素的生物合成过程中，所用的碳源为植物油，其主要的作用是为泰乐内酯的合成提供前体物质，即弗氏链霉菌经过诱导产生脂肪酶，水解植物油为脂肪酸和甘油，然后被菌体通过β_氧化途径利用。在植物油被水解成脂肪酸和甘油后，使局部区域内的pH呈微酸性。基于此，本专利技术在培养基中添加罗丹明B(Rhodamine B),使水解圈呈现出粉红色，根据菌落水解圈的直径与菌落直径比值，挑选符合要求的优良菌株，这样大大减少了工作量，提高了筛选效率，增加选中高产菌株的几率，避免了高产菌株被丢掉的可能。同时，本专利技术利用一个菌落同时接斜面和摇瓶种子，比传统的由菌落到斜面再到摇瓶的筛选方法提前两周出结果，提高了工作效率。同样的，本专利技术利用弗氏链霉菌在不同氮源条件下的脂肪酶活为指标可选择出适合于其生长的培养基配方，从而提高发酵效价。【具体实施方式】下面用实例予以说明本专利技术，应该理解的是，实例是用于说明本专利技术而不是对本专利技术的限制。本专利技术的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。实施例1:菌种筛选1、弗氏链霉菌孢子悬浮液的获得为:将培养好的弗氏链霉菌菌株新鲜斜面上加入9mL无菌水，用接种环刮去培养物表明的孢子，首先轻轻地，然后逐渐用力刮，以使孢子悬浮。将此粗制的孢子悬液倒入离心管中，并在振荡器上尽可能地激烈振荡lmin左右，用装有脱脂棉的试管过滤悬液，将滤液倒入离心管中，3000r/min离心lOmin以使孢子沉淀，停止离心后，马上倒掉上清液，将离心管在振荡器上振荡几秒钟，使孢子沉淀物分散于残存的一点无菌水中，再用无菌水洗涤两次，放入装有玻璃珠的三角瓶振荡10-15min打碎孢子团块，以脱脂棉过滤，采用血球计数板进行孢子计数，调整孢子浓度到约10_4个/ml，备用。2、将制备好的孢子悬液稀释至10_4，每个培养皿各吸取200ul稀释好的孢子悬液涂布到分离平板培养基上，28°C培养7~10天，根据菌落水解圈的直径与菌落直径比值，选择比值相对较大的单菌落。所用的分离平板培养基组成为玉米淀粉18g，植物油5~10g，硝酸铵lg，磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，七水硫酸锌0.01g,罗丹明B 5-lOmL琼脂30g,无盐水加至lOOOmL，灭菌前pH调到7.2。上述植物油为豆油、菜籽油或玉米油。表1分离平板培养筛选结果比较菌株|菌落直径与水解圈的比值|菌落形态|效价(U/mL)对照(不加罗丹宁)it照培养后，不会出现水解圈。只有菌落直径(大约2-4mm)—馒头形,孢子生长丰满1^2501.1.6￥头形,孢子生长丰满，边缘不整齐 136652' 1.4革帽形,孢子丰满,边缘锯齿状130003.1.7軍帽形,孢子丰满，边缘不整齐142004|l.9丨草帽形，孢子丰满，边缘整齐|l6400 -3、将选择出来的单菌落一部分接斜面，另一部分接摇瓶考察效价。实施例2:培养基筛选取3-6 cm2新鲜斜面的弗氏链霉菌菌种接入种子培养基(种子瓶培养基:豆饼粉4 g/L；酵母膏4 g/L;玉米浆5 g/L;碳酸钙3 g/L。120°C灭菌30 min)中，于温度27~29 °C、湿度30~50%、摇床转速230 r/min的条件下培养44~50 h。将培养的种子液以5%的接种量接种到以不同氮源为基础的摇瓶培养基中，摇床220r/min，29°C，发酵144_160h。发酵培养后每24h测定脂肪酶活力，测定方法参照我们工业部批准颁发的行业标准《工业酶制剂通用试验方法》中关于脂肪酶的测定方法，并以第一天的酶活力为指标筛选新配方，结合放瓶后摇瓶效价对其验证。摇瓶发酵培养基组成为:有机氮源10g，玉米淀粉20g，植物油30g，甜菜碱1.5g，磷酸氢二钾0.5g,硫酸镍0.0044g,硫酸镁0.lg,氯化钠1.lg,氯化钾1.lg,轻质碳酸韩2.2g,无盐水加至lOOOmL pH7.2。所述有机氮源为棉籽饼粉、鱼粉、黄豆饼粉、玉米蛋白粉、玉米浆、酵母粉、菜籽饼粉和蚕蛹粉中的一种或几种。表2以脂肪酶为指标筛选泰乐菌素发酵培养基的结果本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以脂肪酶活为指标快速筛选泰乐菌素高效价菌株的方法，其特征是：在以植物油为主要碳源的分离平板培养基中加入罗丹明B，然后涂布弗氏链霉菌孢子悬浮液进行平板培养，培养结束后挑选菌落水解圈直径与菌落直径比大的单菌落，将该单菌落一部分接斜面，另一部分接摇瓶培养基考察效价。
【技术特征摘要】
1.一种以脂肪酶活为指标快速筛选泰乐菌素高效价菌株的方法，其特征是:在以植物油为主要碳源的分离平板培养基中加入罗丹明B，然后涂布弗氏链霉菌孢子悬浮液进行平板培养，培养结束后挑选菌落水解圈直径与菌落直径比大的单菌落，将该单菌落一部分接斜面，另一部分接摇瓶培养基考察效价。2.按照权利要求1所述的以脂肪酶活为指标快速筛选泰乐菌素高效价菌株的方法，其特征是:所述罗丹明B的用量为每1000ml分离平板培养基中加入5~10ml。3.按照权利要求1所述的以脂肪酶活为指标快速筛选泰乐菌素高效价菌株的方法，其特征在于所述分离平板培养基的组成为:玉米淀粉18g，植物油5~10g，硝酸铵lg，磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，七水硫酸锌0.01g, Rhodamine B 5~10mL,琼脂30g，无盐水加至1000mL，灭菌前pH调到?....
【专利技术属性】
技术研发人员：王义，李康乐，
申请(专利权)人：宁夏泰瑞制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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