高耐受细胞株的筛选方法技术

本申请涉及生物工程技术，尤其涉及筛选高耐受细胞株的方法。在本申请的一个方面，本申请提供了一种高耐受细胞株的筛选方法，该方法包括：选取可生长细胞株，将其进行体外培养，改变细胞培养条件从而迫使细胞在不良生长环境中生长代谢，进而筛选获得适应于所述不良生长环境的高耐受细胞株，所述改变的细胞培养条件包括细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度或搅拌速度，或者所述细胞培养条件的两种或两种以上的任意组合。通过本申请筛选得到的高耐受细胞株特别适用于生物反应器的大规模培养。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为201210051119.2、申请日为2012年3月1日、专利技术名称为“高耐受细胞株的筛选方法”的中国专利技术专利申请的分案申请。
本申请涉及生物工程技术，特别是适合于大规模生产用的高耐受细胞株的筛选和培养方法。
技术介绍
生物反应器在动物细胞规模化培养中的应用也是生物制药领域的发展趋势，很多生物制药公司均致力于开发相关产品的发酵工艺，以满足公司产品能够在低成本大规模情况下进行产品的制备。随着全球对生物制品的需求量的增大，生物反应器的规模也不断地提高。此时，动物细胞大规模培养也就成了生物制药领域最重要的关键技术之一。但是，在发酵规模不断放大的过程中，细胞生长的微环境发生了很大的变化，细胞生长受到显著影响，甚至导致细胞死亡。当细胞高密度生长达到一定程度，由于其自身特性不同，其工艺参数耐受情况也不尽相同。随着细胞密度的增长，主要底物氧化还原代谢加剧，传质及传热过程需要进行调整，加大搅拌及提高通气量是最主要的手段，伴随而来的是细胞不可避免的受到的一系列物理损伤。底物的大量消耗会导致副产物的大量产生，对各类细胞有较高的毒性，同时，底物耗竭会造成细胞生长代谢停滞进而导致大量细胞快速死亡。因此，工艺参数是限制发酵规模的重要问题，各种工艺的开发依赖于细胞株能够耐受微环境各项参数指标的变化，筛选获得能够在生物反应器中的高耐受细胞株显得尤为重要。采用高耐受细胞株，不仅能够实现细胞株在无血清、无蛋白或者化学成分限定培养基中的生长代谢和产物表达，同时，还能大幅度的提高细胞株的生长代谢机能，增强细胞株抵抗微环境的各种恶劣变化，以此实现控制细胞增殖水平、延长细胞培养周期，解决规模化放大参数的限制、降低成本等目标，进而提高规模化培养的效能。
技术实现思路
本申请涉及适合于大规模生产用的高耐受细胞株的制备和筛选方法。本申请的一方面提供了一种高耐受细胞株的筛选方法，包括：选取可生长细胞株，将其进行体外培养，改变细胞培养条件从而迫使细胞在不良生长环境中生长代谢，进而筛选获得适应于所述不良生长环境的高耐受细胞株，其特征在于，所述改变的细胞培养条件包括：细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度或搅拌速度，或所述细胞培养条件的两种或两种以上的任意组合。在一些实施方式中，本申请的高耐受细胞株的筛选方法包括改变两种或两种以上选自以下组的细胞培养条件：细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度以及搅拌速度。在一些实施方式中，可改变三种或三种以上所述的细胞培养条件。在一些实施方式中，可改变四种或四种以上所述的细胞培养条件。在一些实施方式中，可改变五种或五种以上所述的细胞培养条件。在一些实施方式中，可改变六种或六种以上所述的细胞培养条件。如果通过改变或调整多种细胞培养条件来筛选高耐受细胞株，所述细胞培养条件可同时改变或调整，也可分先后分别改变或调整，也可以有些培养条件同时改变，有些培养条件单独改变。例如，在一些实施方式中，可同时改变细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度以及搅拌速度，将细胞进行培养，挑选出适应于改变后的培养条件的高耐受细胞株。在一些实施方式中，在细胞培养过程中可以按预定的顺序依次改变培养条件，比如先改变渗透压，再改变乳酸浓度，再改变氨浓度，再改变pH值，再改变溶氧浓度，再改变搅拌速度等，又比如先改变渗透压，再改变搅拌速度，再改变乳酸浓度和氨浓度等，又比如先改变渗透压和pH值，再改变搅拌速度，再改变乳酸浓度和氨浓度等。在一些实施方式中，在细胞培养过程中改变的细胞培养条件中至少有两种分别进行改变，即不是同时改变。例如，在一些实施方式中，先改变初始细胞密度、渗透压、pH值和搅拌速度，然后再改变乳酸浓度和氨浓度。在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是逐步提高渗透压使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，以预定的梯度，比如50mΩ或100mΩ，逐步提高渗透压。在一些实施方式中，培养液中初始的渗透压为大约280mΩ或320mΩ。在一些实施方式中，培养条件中渗透压改变的范围为300～600mΩ。在一些实施方式中，培养液中渗透压被一次性调整到预定的极限渗透压值，例如400mΩ、500mΩ或600mΩ，直接筛选出可在极限渗透压值条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是逐步降低溶氧浓度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，以预定的梯度，比如5％或10％，逐步降低溶氧浓度。在一些实施方式中，培养液中初始溶氧浓度为80％或70％。在一些实施方式中，培养液中溶氧浓度的范围在10％-80％、20％～80％、或者30％-80％。在一些实施方式中，培养液中溶氧浓度被一次性调整到预定的极限溶氧浓度值，例如10％或15％，直接筛选出可在极限溶氧浓度条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是逐步提高乳酸浓度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，以预定的梯度，比如5mM、10mM、20mM、40mM或80mM，逐步提高乳酸浓度。在一些实施方式中，培养液中初始乳酸浓度为0mM。在一些实施方式中，细胞培养条件中乳酸浓度的改变范围为0～60mM，0～80mM，0～100mM或1～120mM等。在一些实施方式中，培养液中乳酸浓度被一次性调整到预定的极限乳酸浓度值，例如110mM或120mM，直接筛选出可在极限乳酸浓度条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是逐步提高氨浓度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，以预定的梯度，比如2mM、4mM、6mM、8mM、10mM,逐步提高氨浓度。在一些实施方式中，培养液中初始氨浓度为0mM。在一些实施方式中，细胞培养条件中氨浓度的改变范围为0～10mM，0～15mM，或0～20mM等。在一些实施方式中，培养液中氨浓度被一次性调整到预定的极限氨浓度值，例如10mM或20mM，直接筛选出可在极限氨浓度条件下存活的、生长代谢状态良好的高耐受细胞株。在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是同时逐步提高乳酸浓度和氨浓度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是同时逐步提高乳酸浓度、氨浓度以及渗透压使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。在一些实施方式中，改变细胞培养条件可以是同时逐步提高乳酸浓度、氨浓度以及pH值使得预本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高耐受细胞株的筛选方法，包括：选取可生长细胞株，将其进行体外培养，改变细胞培养条件从而迫使细胞在不良生长环境中生长代谢，进而筛选获得适应于所述不良生长环境的高耐受细胞株，其特征在于，所述改变的细胞培养条件包括：细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度或搅拌速度，或者所述细胞培养条件的两种或两种以上的任意组合。

【技术特征摘要】
1.一种高耐受细胞株的筛选方法，包括：选取可生长细胞株，将其进行体外培养，改变
细胞培养条件从而迫使细胞在不良生长环境中生长代谢，进而筛选获得适应于所述不
良生长环境的高耐受细胞株，其特征在于，所述改变的细胞培养条件包括：细胞培养
液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度或搅拌速度，或者所述细胞培养条
件的两种或两种以上的任意组合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改变两种或两种以上所述的细胞培养条件。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的改变的细胞培养条件中至少有两种分
别进行改变。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改变细胞培养条件是逐步提高渗透压使得预
定的细胞生长参数达到预定的极限值。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改变细胞培养条件是逐步提高乳酸浓度使得
预定的细胞生长参数达到预定的极限值。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改变细胞培养条件是逐步提高氨浓度使得预
定的细胞生长参数达到预定的极限值。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改变细胞培养条件是同时逐步提高乳酸浓度
和氨浓度使得预定的细胞生长参数达到预定的极限值。
8.如权利要求1所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：屈颖，陈小春，
申请(专利权)人：江苏太平洋美诺克生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32