细胞内表型筛选制造技术

本发明专利技术涉及用于鉴定涉及细胞表型的细胞靶标的方法，所述方法包括鉴定能修饰细胞表型的胞内抗体，以及鉴定胞内抗体直接或间接的细胞靶标。本发明专利技术还涉及胞内抗体3H2-1、3H2-VH和5H4，其能抑制由过敏性刺激引发的肥大细胞中的脱颗粒反应，并且本发明专利技术具体涉及胞内抗体3H2-1和5H4，其能够直接或间接地分别靶向ABCF1家族蛋白和C12ORF4家族蛋白。本发明专利技术还涉及ABCF1和C12ORF4抑制剂用于治疗中的用途，尤其是用于治疗过敏和/或炎症反应。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】细胞内表型筛选 本专利技术涉及用于鉴定涉及细胞表型的细胞靶标的方法，包括鉴定能修饰细胞表型 的胞内抗体和鉴定胞内抗体的直接或间接的细胞靶标。本专利技术还涉及能抑制由过敏性刺激 引发的肥大细胞上的脱颗粒反应的胞内抗体，尤其是涉及胞内抗体3H2-U3H2-VH和5H4， 并且具体涉及胞内抗体3H2-1和5H4,其能够直接或间接地分别靶向ABCF1家族的蛋白和 C120RF4家族的蛋白。本专利技术还涉及ABCF1和C120RF4抑制剂，其用于治疗中的用途，尤其 是用于治疗过敏和/或炎症状况。 对与给定表型有关的细胞靶标的鉴定是更好地理解该表型潜在的细胞机制的基 本如提。具体而目，鉴定与医疗状况有关的细胞革G标是制药工业的巨大兴趣所在，因为其使 得能够设计新的治疗，所述治疗对这些靶标有效果，并能用于治疗或诊断医疗状况。细胞表 型可能经常与给定的病理学有关。因此，能够允许对修饰细胞表型的分子进行鉴定的测定 (表型筛选）能对药物设计有巨大帮助。对与给定表型有关的新细胞靶标的鉴定对其他行 业也是重要的，例如在化妆品中或在植物和食品工业中。 理解已知或未知的细胞分子在给定表型中起的作用并不是件容易的事，这尤其是 因为细胞途径是高度复杂的并且因为许多细胞内分子在若干不同的细胞途径中起作用。因 此，使靶蛋白失活（例如通过RNA干扰）能对一些细胞途径具有调节作用并且因此产生一 些伴随的表型效应，所述表型效应可能彼此难以区分。此外，许多细胞蛋白能呈现不同的构 象和/或可以包含翻译后修饰如磷酸化的氨基酸，并且因此可以与或不与另一个分子相互 作用，作为它们的构象的功能或翻译后修饰的功能。因此，能够允许对那些造成给定表型的 细胞靶标进行筛选，并且甚至对呈特定构象和/或经修饰的或未经修饰的状态的靶标进行 筛选而不使这些细胞靶标完全失活的技术，对于更好地理解一些细胞途径是具有极高价值 的工具。 抗体可被视为精密工具，因为它们对它们的靶标是高度特异性的，并且能针对蛋 白的几乎任何部分产生，并且尤其是针对较大的平面区域（蛋白相互作用常在此处发生， 并且其更难用小有机分子或肽靶向）产生。然而，天然抗体不适应于细胞内环境，因为它 们的尺寸大并且因为细胞质的还原环境阻止了二硫桥的形成，并因此阻止了抗体的适当折 叠。已经开发了重组抗体，其中包括scFv、双抗体和sdAb，用于细胞内环境中的表达。将它 们称为"细胞内抗体"或"胞内抗体"。 专利技术人的团队近期所描述的一个应用，是将根据其对靶抗体（或"Ab"）的调节效 果预先选出的胞内抗体用于筛选小分子文库的用途（欧洲专利EP1743178B1)。其目的在于 分离出能模拟感兴趣的scFv的细胞内作用并且可以体内使用的候选药物。专利技术人将Ab的 这种ELISA置换应用在过敏模型中。同一团队此前的工作已分离出了针对酪氨酸激酶Syk 的SH2结构域的scFv，所述结构域与肥大细胞激活的早期阶段有关。已经显示，这种scFv在 肥大细胞系中的细胞内表达抑制了由IgE受体激活所诱导的过敏递质（mediator)的释放， 而不干扰Syk的激酶活性（Dauvillier等，2002)。开发出了Ab置换测定（Abdisplacement assay)来分离抗-SykscFv的分子模拟物。以这个方式，对3000种分子的化学文库进行筛 选，结果鉴定出了一种分子，指定为C-13。这种分子具有高抗过敏潜能，因为进一步的研究 证明了其在小鼠中体外抑制肥大细胞激活的能力以及体内抑制过敏性休克的能力（Mazuc等，2008)。通过结构分析和定向诱变还鉴定出了C-13与Syk相互作用的位点。在Syk的 两个SH2结构域之间的界面处鉴定出的腔（cavity)被用于对500000种分子的文库进行计 算机中的（insilico)第二次筛选。以这种方式，按照其抑制过敏递质释放的能力选出了 85种非酶的Syk抑制剂（Villoutreix等，2011)。Inoue等（2011)描述了用随机化的细胞内骆驼科动物VHH文库进行的功能缺 失筛选。作者认为常规VH结构域在细胞内环境中是不可溶的。在相应的日本专利申请 JP2008-136455中，Inoue等的作者也认为scFvs在细胞内功能缺失筛选的背景下是无用 的，因为其细胞内稳定性和功能性低。 专利技术人开发出了基于使用细胞内抗体（或"胞内抗体"）的新的表型筛选技术，用 于鉴定能对细胞途径起作用并调节感兴趣的表型的细胞靶标。本工作描述了首例用细胞内 人抗体片段在哺乳动物细胞中进行的表型选择。 专利技术人开发出的新方法允许鉴定与给定表型有关的细胞内靶标，并且尤其是未知 的细胞内靶标或已知的此前未与给定表型联系在一起的靶标。专利技术人使用这项技术鉴定出 两种RBL-2H3细胞克隆，称为3H2和5H4,其分别表达抗体片段3H2-1和3H2-VH，以及5H4。 当在肥大细胞中表达时，这些抗体片段抑制脱颗粒反应，所述脱颗粒反应通常由过敏挑战 而引发。专利技术人还鉴定出了两种蛋白，ABCF1和L0C297607,它们分别能与3H2-1和5H4 - 起沉淀。专利技术人证明了L0C297607涉及肥大细胞脱颗粒，对于L0C297607现有技术中没有 记载已知的功能。 用于在蛋白质组规模实现表型筛选的细胞内Ab的选择提供了诸多优势。确实，当 在细胞中表达时，它们能干扰蛋白功能并进而产生给定的表型。此外，伴随着它们的高亲和 性和特异性特性，它们潜在地能够靶向细胞中的任何分子，尤其是蛋白，以及更精确地说靶 向一些亚结构域或转录后修饰（其可能涉及具体的信号传导）。在疾病模型的背景下，细胞 内抗体提供的另一个优点是，当它们的靶标被鉴定出来时，它们便能用于指导药物开发。 更具体而言，高多样性的且针对细胞内表达进行优化后的组合的（combinatory) scFv文库的使用，使专利技术人能进行大规模表型筛选。将这种筛选应用于肥大细胞激活的模 型，它们在这个信号传导途径中鉴定出了新的分子参与者（molecularplayer)。 这个方法最初是用允许scFv文库在肥大细胞系中表达的质粒系统开发出来的。 为了尽可能保持文库的初始多样性，选出了施行多拷贝表达模式的转染条件。进行了表型 选择，其导致呈现感兴趣的表型且表达scFv的细胞富集，所述scFv抑制所研究的信号传导 途径。两种具体抗体（Ab)片段3H2-1和5H4在肥大细胞系RBL-2H3中的表达，强烈抑制了 细胞释放过敏递质的能力。在产生它们以后，将这些抗体体外使用，以通过免疫沉淀实验与 质谱法联用来鉴定它们的蛋白靶标。蛋白ABCF1和L0C297607从而分别被鉴定为3H2-1和 5H4的靶标。L0C297607(或"L0C"）是此前功能未知的蛋白，其似乎涉及经过FcεRI的肥大细 胞激活。的确，用shRNA的实验的初步结果提示其干预对受体激活后的早期事件以及对过 敏递质释放的稍后事件的调控。在肥大细胞中通过评估干预由FcεRI介导的信号转导的 蛋白的活性等来更精确地鉴定蛋白L0C的分子配偶体（partner)会是有趣的。 此外，一些基因组数据提示蛋白L0C和炎症之间的联系。一项用染色体定位作图 技术的研究通过在猪中的杂交辐射显示了LOC的染色体基因座可能与炎症有关，并且更具 体与特定本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定涉及细胞表型的细胞靶标的方法，该方法包括：a)鉴定包含免疫球蛋白的完整VH和/或VL结构域的胞内抗体，当其存在于细胞内时其能诱导、修饰或抑制所述表型；b)鉴定细胞靶标，其是所述细胞中所述胞内抗体的直接或间接靶标；并任选地c)分离所述细胞靶标。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·达里亚瓦赫，P·马蒂诺，C·哈恩，
申请(专利权)人：赛诺菲，法国国家健康与医学研究院，蒙彼利埃大学，法国蒙彼利埃癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：法国;FR