对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法技术

本发明专利技术提供一种可迅速且以低成本实施并且可取得可信度高的数据的、对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法。本筛选方法包含如下工序：（a）在可形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，（b）使所述细胞与被实验物质接触的工序，（c）以球状体的形态的变化作为指标来评价被实验物质对于所述细胞的上皮性维持所产生的效果的工序。此时，所述工序（c）可通过测定规定尺寸的球状体数量和/或通过测定球状体内的低氧区域来评价。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种以球状体（spheroid)的形态的变化为指标来筛选对细胞的上皮 性维持起作用的物质的方法。
技术介绍
上皮-间质转化（Epithelial-MesenchymalTransition:EMT)是指细胞无法维持 作为上皮的特性而获得作为间质系的特性的现象。近年来，报道了上皮-间质转化参与癌 细胞的浸润、转移和/或组织的重塑（remodeling)、纤维化等。因此，人们期待将对细胞的 上皮性维持起作用的物质、即阻碍上皮-间质转化的物质、或诱导出作为上皮-间质转化的 相反现象的间质-上皮转化（Mesenchymal-EpithelialTransition:MET)的物质开发为癌 或纤维症等的治疗药。 以往，作为筛选对细胞的上皮性维持起作用的物质的方法，存在有：使被实验物质 接触被诱导进行了上皮-间质转化的细胞，以表示上皮-间质转化状态的生物标记物量的 变化作为指标来进行评价的方法（例如参照专利文献1)。 现有技术文献 专利文献1 :国际公开号W02009/111067
技术实现思路
专利技术要解决的课题 但是，以生物标记物量为指标的筛选方法的检测耗费工夫和成本。因此，该方法难 以适用于制药初期阶段的筛选那样的必须快速评价大量样品的筛选。另外，存在有低浓度 的生物标记物的检测困难因而缺乏可信度这样的问题。 因此，本专利技术的目的在于提供一种可迅速且以低成本实施、并且可取得可信度高 的数据的。 用于解决课题的手段 本专利技术人等发现了，在作为上皮细胞所表达的细胞间粘接因子的E-cadherin的 表达量与在规定的培养基材上培养的细胞所表现的行为之间存在有相关关系。即发现了， 如果因上皮-间质转化而使得E-cadherin的表达降低而无法维持细胞的上皮性时，则该细 胞获得高的迀移能力而变为在规定的培养基材上容易形成球状体的状态，并且形成的球状 体根据E-cadherin的表达量而呈现不同的形态。然后，作为以球状体形态的变化为指标的 筛选方法，完成了本专利技术。 本专利技术的要旨如下所述。 本专利技术的的特征在于，包含如下工 序：(a)在可形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，（b)使所述细胞与被实验物质接触 的工序，（c)以球状体的形态的变化作为指标来评价被实验物质对于所述细胞的上皮性维 持所产生的效果的工序。 在此情况下，所述工序（c)可通过测定规定尺寸的球状体数量来评价。 另外，所述工序（c)可通过使用可检测球状体内的低氧区域的试剂来评价。 所述工序（a)可在具有作为细胞粘接面而起作用的规定的凹凸结构的培养基材 上进行。 在此情况下，所述凹凸结构优选为通过将包含规定的平面形状的单元结构规则地 进行多个排列而得到的凹凸结构。 另外，凹凸结构可以是通过将单元结构间的宽度为3 ym以下、平面方向的形状为 多边形并且最小内径为3 ym以下的单元结构规则地进行多个排列而形成的凹凸结构。 专利技术效果 本专利技术的筛选方法由于以球状体的形态的变化作为指标来进行评价，因而可迅速 且以低成本筛选目标物质。另外，由于是利用了可认为相比于单层细胞而言更反映了接近 生物体内的状态的球状体的方法，因而可有效地进行筛选。进一步，由于可同时地捕捉多个 指标来评价，因此可获得可信度高的筛选结果。【附图说明】 图1是表示本专利技术方法中使用的培养基材的凹凸结构的俯视图。 图2是表示球状体的形态的照片。 图3是表示E-cadherin的表达量的照片以及图表。图4是表示上皮-间质转化阻碍剂对球状体的形态所产生的效果的显微镜照片。 图5是表示低氧区域检测试剂的信号强度的图表。 图6是表示E-cadherin基因的表达量的图表。 图7是表示N-cadherin基因的表达量的图表。 图8是表示Vimentin基因的表达量的图表。 图9是表示ZEB1基因的表达量的图表。 附图标记说明：1单元结构 2 线【具体实施方式】 本专利技术的筛选方法包含如下工序：（a)在可形成球状体的培养基材上培养细胞的 工序，（b)使所述细胞与被实验物质接触的工序，（c)以球状体的形态的变化作为指标来评 价被实验物质对于所述细胞的上皮性维持所产生的效果的工序。 本专利技术中的球状体是指细胞彼此三维地进行聚集、凝集化而得到的细胞聚集体。另外，本专利技术中的细胞的上皮性维持是指抑制、阻碍了上皮-间质转化的状态，或 者促进、诱导了间质-上皮转化的状态。因此，本专利技术的筛选方法大致划分为阻碍上皮-间 质转化的物质的筛选方法以及诱导间质-上皮转化的物质的筛选方法。 关于阻碍上皮_间质转化的物质的筛选方法，例如可通过如下工序来进行：在可 形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，使该细胞与上皮-间质转化诱导剂接触的工 序，使培养细胞与被实验物质接触的工序，以球状体的形态的变化作为指标来评价被实验 物质对于细胞的上皮-间质转化产生的效果的工序。作为上皮-间质转化诱导剂，例如可 使用TGF-0、TNF-a、EGF、IL-4等。另外，关于使培养细胞与上皮-间质转化诱导剂接触 的工序，如果是在使培养细胞与被实验物质接触的工序以前，则可在任一时间点进行，例如 可在细胞接种时进行，也可在细胞接种后经过数天后进行，也可与使培养细胞与上皮-间 质转化诱导剂接触的工序同时地进行。 关于诱导间质_上皮转化的物质的筛选方法，例如可通过如下工序来进行：在 可形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，使培养细胞与被实验物质接触的工序，以球 状体的形态的变化作为指标来评价被实验物质对于细胞的间质_上皮转化产生的效果 的工序。在该方法中，优选使用E-cadherin表达量低的细胞、例如人胰腺癌衍生细胞株 MIAPaCa-2、PANC-l、A1165等来进行。此外，也可在通过插入使培养细胞与上皮-间质转化 诱导剂接触的工序而诱导为间质系细胞之后，使被实验物质与培养细胞进行接触。特别是， 使用上皮癌（例如A549)和/或腺癌（例如Capan-2)等的细胞的情况下，优选在接种时进 行利用上皮-间质转化诱导剂的处理。 本专利技术中的以球状体的形态变化为指标的评价可通过比较负对照组与被实验样 品组的球状体的外观及/或内部结构的差异来进行。 关于外观的差异，可将球状体的形状（圆形度）、尺寸、数量等的变化设为指标。例 如，与负对照组相比，在被实验样品组中在球状体的尺寸变大了的情况下，和/或规定的尺 寸以上的球状体数量增加了的情况下，和/或球状体的圆形度更接近1的情况下，被实验物 质可评价为是具有维持细胞的上皮性的效果的物质。另外，代替以规定的尺寸以上的球状 体数量的变化为指标（或者与其并进），也可将没有形成球状体的细胞数量的变化设为指 标。这是因为，可将其认为是球状体形态变化的一个方式。当前第1页1 2 3 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法，其特征在于，包含如下工序：(a)在可形成球状体的培养基材上培养细胞的工序，(b)使所述细胞与被实验物质接触的工序，(c)以球状体的形态的变化作为指标来评价被实验物质对于所述细胞的上皮性维持所产生的效果的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：伊藤学，新井一也，梶田浩志，田中觉，
申请(专利权)人：JSR株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP