【技术实现步骤摘要】
本专利技术利用基因工程技术，构建了体外转录载体及能够诱导猪胚胎成纤维细胞转 变成猪多能干细胞的6个关键基因的体外转录质粒，用于诱导猪的成纤维细胞成猪多能干 细胞，为建立人类疾病模型提供了基本条件，该专利技术属于基因工程领域。
技术介绍
猪是最适合人类器官移植和建立人类疾病模型的动物，但猪的疾病模型大多数用 基因敲除技术得到基因敲除的体细胞然后利用核移植的技术产生可继续发育的卵母细胞， 从而得到基因敲除猪。但在这个过程中存在基因敲除效率低，孕期流产率高，初生仔猪有缺 陷等问题；此外，猪的干细胞分离至今没有成功，所以根据Yamanaka研究小组的实验方法， 在成纤维细胞中转入几个干细胞的关键基因就能将成纤维细胞转变成多能干细胞。目前， 利用脂质体等转染试剂对成纤维细胞的多基因转染效率非常低，导致转入的基因量不同， 但用逆转录病毒携带基因用其感染成纤维细胞的方法得到的基因敲除猪又存在生物安全 性的问题。因此，我们试图在体外大量转录维持干细胞自我更新的猪的6个关键基因，然后 将其mRNA转入猪胚胎成纤维细胞后使其变成猪的多能干细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是构建...
【技术保护点】
维持干细胞自我更新的６个猪源关键基因的体外转录质粒的构建，其特征在于具体制备方法如下：首先设计基因体外转录空载体Ｖｉｔｒｏ－ＴｒａｎｓＰＭＤ－１８Ｔ，然后获得ＥＧＦＰ和维持干细胞自我更新的猪源的６个关键基因的ｃＤＮＡ，并按相应的酶切位点进行酶切连接，最后用体外转录试剂盒对７个体外转录质粒进行体外转录，得到相应的ｍＲＮＡ，然后将Ｖｉｔｒｏ－Ｔｒａｎｓ－ＥＧＦＰ转染进猪胚胎成纤维细胞：（１）、基因体外转录载体的构建用重叠延伸ＰＣＲ的方法得到１０４ｂｐ的序列，包括Ｔ７启动子，增强翻译效率的ｍｉｎｕｓＣＴ，包含ＡＴＧ起始密码子的５’ＵＴＲ和一段包含酶切位点的无关序列；然后连接进入Ｐ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳红生，唐小春，逄大欣，周杨，朱建国，赖良学，陈月，段新平，张明军，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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