成人干细胞的体外扩增制造技术

本发明专利技术公开了用于操纵和扩增包括成人干细胞在内的干细胞群体的方法、通过这种方法产生的细胞以及与其相关的各种蛋白质构建体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】成人干细胞的体外扩增 相关申请的交叉引用 本申请要求2013年3月11日提交的美国临时申请No. 61/776, 422和2013年3 月12日提交的美国专利技术申请No. 13/795, 659的权益和优先权，将该临时申请和专利技术申请以 引用方式整体并入本文。 政府利益 本专利技术是在美国国立卫生研究院（National Institute of Health)授予的编号 为5R44HL091740-03的政府资助下作出的。政府在本专利技术中具有某些权利。 序列表、表格或计筧机稈序表的引用 本申请随电子格式的序列表一起提交。该序列表作为2014年3月10日创建的标 题为"106417-0182_5叫_1^5^.丨#"的文件提供，大小为101?字节。电子格式的该序列表 中的信息以引用方式整体并入本文。
本文提供涉及长期干细胞、产生这类细胞的方法以及各种蛋白质构建体的实施 例。
技术介绍
长期造血干细胞（LT-HSC)是存在于成人骨髓中并产生全部成熟红细胞组库的稀 有祖细胞。这些细胞对于所有红细胞区室的维持是必要的。在针对恶性血液病、自身免疫 性和免疫缺陷等的疗法中，干细胞移植可以是一种有用的辅助疗法。
技术实现思路
在一些实施例中，提供一种产生条件性无限增殖化成人干细胞群体的方法。该方 法可包括向一种或多种成人干细胞提供外源合成的能促进细胞存活或增殖中的一者或多 者的Myc多肽和外源合成的能抑制凋亡的Bcl-2结构域多肽。在一些实施例中，该Myc多 肽以至少约72小时的时间间隔提供给该一种或多种成人干细胞并且该Bcl-2结构域多肽 以至少约96小时的时间间隔提供给该一种或多种成人干细胞，以产生条件性无限增殖化 成人干细胞群体。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不 超过每小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不 超过每两小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率 不超过每三小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频 率不超过每四小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的 频率不超过每五小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽 的频率不超过每六小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多 肽的频率不超过每七小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc 多肽的频率不超过每八小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc 多肽的频率不超过每九小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc 多肽的频率不超过每十小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc 多肽的频率不超过每^^一小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该 Myc多肽的频率不超过每十二小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或 该Myc多肽的频率不超过每十三小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/ 或该Myc多肽的频率不超过每十四小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽 和/或该Myc多肽的频率不超过每十五小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域 多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十六小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结 构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十七小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2 结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十八小时一次。在一些实施例中，供应该 Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十九小时一次。在一些实施例中，供应 该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十小时一次。在一些实施例中， 供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二^^一小时一次。在一些实施 例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十二小时一次。在一 些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十三小时一次。 在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十四小时 一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每三十六 小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每 四十八小时一次。 在一些实施例中，提供Myc融合蛋白。该融合蛋白包含蛋白转导结构域、能促进细 胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽、V5结构域和六组氨酸表位标签。 在一些实施例中，提供干细胞扩增培养基。该扩增培养基包含IL3、IL6、干细胞因 子、促血小板生成素、Flt3-L和GM-CSF。 在一些实施例中，提供Myc融合蛋白。该Myc融合蛋白包含蛋白转导结构域、能促 进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽。该Myc融合蛋白的半寿期超过约60分钟。 在一些实施例中，提供编码本文公开的任何蛋白质的核酸。 在一些实施例中，提供包含本文提供的任何核酸的载体。 在一些实施例中，提供包含本文提供的任何载体或核酸的细胞。【附图说明】 各个实施例的特征在所附的权利要求书中以具体特征阐述。通过参考下文的"具 体实施方式"和附图，将获得对本专利技术一些实施例的特征和优点的更好的理解，在"具体实 施方式"中阐述利用各个实施例的原理的示例性实施例，而在附图中： 图1A、1B、1C、ID和IE显示Tat融合蛋白的产生和体外表征的示例性实施例。图 IA显示Tat-Myc融合蛋白和Tat-Bcl-2融合蛋白的示意图的示例性实施例，包括HIV-ITat 的框内蛋白转导结构域及V5和6xHis标签的位置。图IB显示从大肠杆菌（E. coli)纯化、 经SDS-PAGE分离并用考马斯染色后的重组蛋白的示例性实施例。图IC显示暴露于纯化 的重组Tat-Myc、Tat-Bcl-2或保持未处理（NT)达两小时，然后用抗V5的单克隆抗体并用 Hoechst 9934核染剂固定和染色的汇合3T3细胞的菌苔的示例性实施例。Tat-Myc蛋白 在这个时间范围主要定位于核区域，而Tat-Bcl-2保持在细胞质和核周空间。图ID显示 经如下处理的源自人脐带血的HSC的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析（抗V5和β -肌动蛋白 的单克隆抗体）：利用Tat-Myc的单次暴露来冲击致敏1小时，洗涤，然后裂解（在指定的 时间点）以将质膜和细胞质级分与核级分分离。图IE显示经如下处理的源自人脐带血的 HSC的核级分的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析（抗V5和β-肌动蛋白的单克隆抗体）：利用 Tat-Myc的单次暴露来冲击致敏2小时，洗涤，然后裂解（在指定的时间点）以将质膜和细 胞质级分与核级分分离。该蛋白质的大部分在24小时至48小时之间失去。在72小时后 的任何时间点没有剩余可检测的蛋白质。 图2A、2B、2C和2D显示表明重组Tat-Myc和Tat-Bcl-2具有生物活性的示意图的 示例性实施例。图2A和2B显示在单独培养基（无处理，NT)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生条件性无限增殖化成人干细胞群体的方法，所述方法包括：向一种或多种成人干细胞提供：a)外源合成的能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽；和b)外源合成的能抑制凋亡的Bcl‑2结构域多肽；并且其中所述Myc多肽以至少约72小时的时间间隔提供给所述一种或多种成人干细胞；并且其中所述Bcl‑2结构域多肽以至少约96小时的时间间隔提供给所述一种或多种成人干细胞，以产生条件性无限增殖化成人干细胞群体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：布赖恩·柯蒂斯·特纳，优素褔·里菲利，G·A·伯德，
申请(专利权)人：泰加生物工艺学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US