用于细胞培养的方法技术

本发明专利技术涉及用于干细胞或祖细胞培养的方法。更准确地说，本发明专利技术涉及使用一种或多种IαI (间α胰蛋白酶抑制剂或间α抑制剂)蛋白或其部分作为细胞培养基的组分或细胞培养表面材料上的包被层的细胞培养的方法。此外，本发明专利技术涉及细胞培养基和由一种或多种I□I蛋白或其部分提供的细胞培养包被层/基质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 专利
本专利技术涉及细胞培养的方法。更准确地说，本专利技术涉及使用一种或多种IaI(间 a胰蛋白酶抑制剂（inter-alphatrypsininhibitor)或间a抑制剂）蛋白或其部分作 为细胞培养基的组分或细胞培养表面材料上的包被层。此外，本专利技术 涉及细胞培养基和以一种或多种IaI蛋白或其部分提供的细胞培养包被层/基质。 专利技术背景 多能干（PS)细胞例如胚胎干（ES)细胞和诱导性多能干（iPS)细胞具有在长期培养期 间维持多能性并且仍诱导分化成多种谱系的能力，因此潜在地提供用于例如基础研究、毒 理学筛选、遗传病症的体外建模或治疗性细胞置换的新的细胞来源。直到可完全实现这些 终点之前，仍有许多障碍要克服。例如寻找支持安全、简单和稳健的衍生化、生长、维持和大 规模扩增，同时保持这些难以培养的细胞的自我更新的培养条件会是必要的。尤其重要的 是需要用于体外维持人PS细胞的方法。这些方法必须足够好以维持细胞群而不诱导诱变、 高水平的分化或多能性的丧失。 小鼠ES细胞广泛用于基础研究以例如研究正常和病理性发育和功能，且使用这 些细胞获得的知识常常转移到人类系统中。现今使用的大多数小鼠ES(mES)细胞系生长 在补充了选定批次的胎牛血清（FBS)和白血病抑制因子（LIF)的培养基中的预先平板接种 去有丝分裂活性的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)饲养细胞上。饲养细胞提供支持mES细胞附 着和分泌提高mES细胞生长存活和繁殖的各种生长因子的基质，而FBS提供激素和必需营 养物，以及改变培养基的生理/生理化学性质。LIF显著提高mES细胞多能性的衍生化和 维持。已衍生出一些mES细胞系，并已适应在含有血清和LIF的培养基中0. 1%明胶包被层 (存在于胶原中的高平均分子量的水溶性蛋白质的异质混合物，并从牛皮肤提取）上无饲 养细胞生长。这两种细胞培养方案有缺点，其组分（即FBS、牛血清白蛋白或BSA、明胶）中 的许多不确定，并且是动物来源的。例如，FBS含有各种生长因子和促进ES细胞生长的其 它不确定的组分，但它还表明含有可能影响mES细胞平板接种效率、生长和分化的潜在分 化因子。因此FBS批次需要预先筛选和ES-合格以确保维持mES细胞维持和生长的血清因 子的净作用超过分化诱导因子的作用。饲养细胞反过来（intheirturm)分泌过多的无法 控制的因子，并且是致病性污染的可能来源。 为了加强控制ES细胞实际上遇到什么因子，并且为了避免来自非所需的因子的 干扰，已建立了若干更新的和更确定的方案。在2003年，已表明BMP4可与LIF组合有效 地在不含血清和饲养细胞的培养物中用于mES衍生化和维持（Qi，Li等人，2004)。在2004 年，开发了化学上确定的（未描述确切配方）合成的敲除血清替代品（syntheticknockout serumreplacement，K0SR)以替代血清。然而，KOSR在缺乏饲养细胞时不能单独支持mES 单细胞培养。在2008年，表明了mES可在缺乏血清和饲养细胞时作为自由漂浮的球体保持 在含LIF和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子）的N2补充培养基，本文称为ESN2培养基中 (Andang，Moliner等人，2008,Moliner，Enfors等人，2008)。 最近，加入B27和N2补充培养基中的补充2种抑制剂，促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)/胞外信号调节激酶（ERK)激酶（MEK)抑制剂H)0325901和糖原合酶激酶3 (GSK3) 抑制剂CHIR99021的另一种确定的培养基（本文称为2i培养基）显示，在不加入外源因子 的情况下维持mES细胞自我更新（Ying，Wray等人，2008)。培养在2i培养基中的小鼠ES细 胞仍对LIF起反应，所述LIF提高克隆效率和增殖速率。这个培养方案的缺点是在血清不存 在时，细胞不附着于组织培养板，而替代地作为自由漂浮的球体生长（Tamm，PijuanGalito 等人，2013);而且，mES细胞的生长速率降低。 人PS(hPS)细胞及其分化细胞最常被在含有动物来源的组分的存在的表面或培 养基的存在下培养，所述组分例如饲养层（小鼠来源的（通常为MEF)和人来源的（通常人 包皮成纤维细胞或HFF)二者）、Matrigel? (Engelbreth-Holm-SwarmEHS肿瘤的可溶性基 底膜提取物）、敲除血清替代品（KOSR)和/或衍生物如BSA。加入培养环境的这些动物来 源的试剂使细胞暴露于潜在有害的病毒或其它感染剂中，其可能转移给患者或损害hPS细 胞的一般培养和维持。另外，这类生物制品对于批次改变、免疫应答和有限的存放期是脆弱 的，并且如果细胞待用于细胞疗法，则细胞暴露于来自其它物种的分子还产生可在接受者 中产生免疫应答的改变。 迄今为止，已描述了几个利用化学上确定的培养基和合成的或确定的表面的完 全重组的无异源物（xeno-free)系统。人PS细胞培养中的最新成就发表于2011年的 Nature方法，其描述了化学上减少且完全确定的培养基，名为E8,只含8种不同的化学组 分，可支持hiPS细胞衍生化和在Matrigel?或基于玻连蛋白的表面上更成功的培养（Chen， Gulbranson等人，2011)。即使如此，当使用确定的培养基时，不同的细胞系和不同的实验 室仍获得不同的结果，而且最广泛使用的方案对于hPS细胞依然是Matrigel?和mTESRl? (其含有从FBS纯化的BSA)的组合；对于mES细胞为明胶包被层和补充FBS的培养基。而 且，如果不是在ROCK抑制剂分子（即Y-27632)的存在下，hPS细胞不能作为单细胞分裂 (Watanabe，Ueno等人，2007)，并且对于常规传代需要使用和缓分离技术以团块分裂，这证 实了胞外环境对多能干细胞的关键作用。 仍急需了解未分化未突变的多能干细胞的生长和维持所必需的所有不同的组分。 重要的是得到胞外基质（ECM)和培养基因子的正确组合用于最佳维持，特别用于人PS细胞 系，否则细胞显示低的附着率、存活率和增殖速率以及高的分化水平。 为了细胞存活和增殖速率，用于细胞培养的当前方案在细胞培养基中仍使用FBS 或衍生物例如BSA，因此，仍需要不损害细胞、培养条件或多能性的改良的无血清方案。 专利技术概述 在本专利技术中，我们发现促进细胞黏着和长期细胞培养活力的因子。更准确地说，本专利技术 提供在部分或完全化学上确定的培养基存在下，间a胰蛋白酶抑制剂（laI)家族蛋白质 或其部分，具体地说HC2 (重链2)作为表面包被层和/或培养基添加剂用于细胞黏着和长 期培养、多能干细胞的维持和生长至少20次传代，而不诱导显而易见的分化或核型异常的 新的用途。 因此，第一方面，本专利技术提供用于干细胞或祖细胞培养的方法，所述方法包括将来 自IaI(间a胰蛋白酶抑制剂）蛋白质家族的一种或多种蛋白质或其部分加入细胞的无 血清培养物中。细胞优选为干细胞。本专利技术的添加会促进自我更新、附着、存活，且在PS细 胞的情况下，还促进多能性。IaI蛋白或其部分自血清分离、作为重组蛋白产生或以化学方 法合成。 细胞优选为黏着细胞，而在一个优选的实施方案中，细胞是PS(多能干）细胞，并 且可为ES(胚胎干本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于干细胞或祖细胞培养的方法，所述方法包括将来自IαI (间α胰蛋白酶抑制剂)蛋白质家族的一种或多种蛋白质或其部分加入细胞的培养物中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S皮朱安加利托，C塔姆，C安尼伦，
申请(专利权)人：通用电气健康护理生物科学股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE