一种适合昆虫细胞生长的无血清无动物源培养基添加物的制备方法技术

本发明专利技术涉及生物制药技术领域，具体涉及一种适合对昆虫细胞(主要包括Sf9和High Five细胞)的无血清无动物源培养的添加物的研制。本发明专利技术以传统培养基Grace或者是IPL-41作为基础，添加有利于昆虫细胞生长的添加物，在培养昆虫细胞的过程当中，能起到代替血清的功能，并且价格低廉，昆虫细胞能够获得240h的连续生长，细胞活力能保持在95％以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制药
，具体涉及一种适合对昆虫细胞主要包括Sf9和HighFive细胞)的无血清无动物源培养的添加物的研制。
技术介绍
目前，常用的昆虫细胞有Sf-9细胞，即：Spodopterafrugiperda(草地贪夜蛾)细胞和HighFive细胞，HighFive细胞(BTI-TN-5B1-4)是来自于粉纹夜蛾(Trichopulsiani)亲本细胞系的克隆分离株，常用于杆状病毒表达载体系统(BEVS)的重组蛋白表达。杆状病毒表达系统(baculovirusexpressionsystem)是近年来应用较多的真核表达系统，它可以在昆虫细胞中表达多种外源基因，包括真菌，植物，细菌，病毒的基因。杆状病毒是一类以昆虫细胞为天然宿主的双链DNA病毒，具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物，对人、畜无害。目前研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)，其宿主是草地贪夜蛾。而Sf-9细胞和HighFive细胞，是杆状病毒表达系统的宿主细胞。在应用于蛋白的表达与制备纯化中，有着许多的优点，包括：表达的重组蛋白能正确折叠，并形成二硫键；翻译后可进行修饰加工如糖基化、磷酸化、酰胺化及信号肽切割等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；与其他真核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以高效表达外源基因，表达量最高可达被感染昆虫细胞总蛋白量的50％；可以容纳大片段外源基因。目前，国内的生产工艺多采用Grace培养基或者IPL-41培养基添加5-10％的小牛血清培养，或者用商业化无血清培养基如SF900II再添加适当血清培养。很多商品号称是无血清培养基，但是，很难做到完全脱离血清培养。另外，由于目前国内血清供应日益紧张伴随着价格不断走高，对国内生物抗体生产企业产生了明显的限制。此外，从生产的角度来讲，血清中含有大量成分复杂的蛋白质，这极不利于疫苗、类病毒颗粒、细胞因子和单克隆抗体等生物制品的下游纯化分离，同时血清所含的化学成分不确定，血清也存在批次稳定性问题，而且还容易引起细菌、真菌、病毒和支原体污染。因此，尽量不用或少用血清成为昆虫细胞培养的趋势，现有技术常通过添加牛血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素等动物源成分，来降低血清的添加量，但是动物源成分的蛋白质对生物制品(如疫苗)的安全性有很大影响，所以迫切需要一种能代替血清功能的细胞培养添加物。既能够使细胞快速生长，保持较高的活力，又减少了污染的可能，提高细胞产品的稳定性，同时减少动物来源的蛋白组分含量，利于后期纯化工艺，降低生产成本。目前，商业化的昆虫培养基有Grace培养基、IPL-41培养基、TC100培养基，这些培养基都是结合血清使用的经典的培养基，也有商业化的无血清培养基如：SF900II，SF900III，ExpressSFM，等系列产品，这些产品价格高且配方保密，且很难完全去除血清培养，不能持续的维持细胞的活力，或者是成本较高，很少有针对于昆虫细胞，研发出替代血清的添加物。本专利技术基于上述的产品现状，开发了适合昆虫细胞悬浮生长的代替血清的细胞添加物，在培养昆虫细胞的过程当中，能起到代替血清的功能，并且价格低廉。以传统培养基Grace或者是IPL-41作为基础，添加有利于昆虫细胞生长的添加物，昆虫细胞能够获得240h的连续生长，细胞活力能保持在95％以上。
技术实现思路
本专利技术目的在于，克服现有技术中的缺陷，提供一种适合昆虫细胞悬浮生长的无血清培养基，培养基研制过程中，用一些具有特殊功能的化合物、脂类成分、酵母和植物水解物、微量元素和维生素代替了培养基中常规添加的动物源成分，在降低血清使用成本的同时，减小了培养基中血清和动物源蛋白携带外源病原菌污染的机率，同时培养基中的蛋白含量大幅减少，十分有利于后期纯化工艺，提高细胞产品的稳定性。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是：提供一种适合昆虫细胞瓶培养的无血清培养基，其特征在于，在常规Grace或者是IPL-41培养基的基础上，添加了氨基酸、脂类、微量元素和水解物成分，用以替代血清的功能，用于无血清的添加量，添加成分如下：葡萄糖3-15g/L,L-精氨酸2-9mM,L-天冬酰胺1-8mM,L-甘氨酸5-14mM,L-组氨酸2.77mM,L-异亮氨酸8.41mM,L-亮氨酸5-11mM,L-赖氨酸4-9mM,L-蛋氨酸0.1-0.7mM,L-苏氨酸1-9mM,L-色氨酸0.2-1.4mM,L-结氨酸，2-5mML-脯氨酸7-10mM,棉籽水解物300-3000mg/L,大米水解物300-3000mg/L,麦麸水解物300-3000mg/L,重组胰岛素2-25mg/L,丙酮酸钠50-300mg/L,亚硒酸钠0.0010.04mg/L,柠檬酸铁0.05-1mg/L,亚油酸0.1-0.3mg/L,大豆卵磷脂10-65mg/L,胆固醇5-25mg/L,环庚三烯酚酮0.1-6mg/L,F-68100-600mg/L,还原型谷胱甘肽0.04-0.5mg/L,L-谷氨酰胺3-15g/L。其中，F-68是pluronicF-68的简称，在细胞培养过程中的常用添加物，对细胞具有保护作用。关于“棉籽水解物”、“麦麸水解物”以及“大米水解物”在本领域中有公认的含义，就是将棉籽，麦麸，大米，经过特殊的工艺，包括酶消化、酸处理等手段进行处理后，提取适合细胞生长组分，目前均有商品化试剂，本专利技术具体使用的是Difico公司生产的水解物。Grace和IPL-41，是成分公开的培养基，目前均有商品化试剂，本专利技术具体使用的是LifeTechnology公司生产的基础培养基。本专利技术研制的无血清培养基添加物，不仅降低了培养基成本而且还大幅减少了培养基中动物源蛋白的含量，简化了无血清培养基研发的过程，更有利于细胞下游产品的分离和纯化。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的另一个技术方案是适合昆虫细胞瓶培养的无血清培养基的配置方法，其特征在于，所述配制方法包括如下工艺步骤：S1：在容器中加注射用水至总体积的90％，将一袋Grace或者是IPL-41培养基全部倒入容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下并入容器，轻微搅拌溶解；S2：将上述组分依次加入到溶液中，轻微搅拌溶解；S3：轻微搅拌至完全溶解，加注射用水至总体积的100％；S4：用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至6.2；S5：用0.2μm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适合昆虫细胞培养的无血清培养基，其特征在于，在常规Grace或者是IPL‑41培养基的基础上，添加成分如下：葡萄糖 3‑15g/L,L‑精氨酸 2‑9mM,L‑天冬酰胺 1‑8mM,L‑甘氨酸 5‑14mM,L‑组氨酸 2.77mM,L‑异亮氨酸 8.41mM,L‑亮氨酸 5‑11mM,L‑赖氨酸 4‑9mM,L‑蛋氨酸 0.1‑0.7mM,L‑苏氨酸 1‑9mM,L‑色氨酸 0.2‑1.4mM,L‑结氨酸， 2‑5mML‑脯氨酸 7‑10mM,棉籽水解物 300‑3000mg/L,大米水解物 300‑3000mg/L,麦麸水解物 300‑3000mg/L,重组胰岛素 2‑25mg/L,丙酮酸钠 50‑300mg/L,亚硒酸钠 0.0010.04mg/L,柠檬酸铁 0.05‑1mg/L,亚油酸 0.1‑0.3mg/L,大豆卵磷脂 10‑65mg/L,胆固醇 5‑25mg/L,环庚三烯酚酮 0.1‑6mg/L,F‑68 100‑600mg/L,还原型谷胱甘肽 0.04‑0.5mg/L,L‑谷氨酰胺 3‑15g/L。

【技术特征摘要】
1.一种适合昆虫细胞培养的无血清培养基，其特征在于，在常规Grace或者是IPL-41培
养基的基础上，添加成分如下：
葡萄糖3-15g/L,
L-精氨酸2-9mM,
L-天冬酰胺1-8mM,
L-甘氨酸5-14mM,
L-组氨酸2.77mM,
L-异亮氨酸8.41mM,
L-亮氨酸5-11mM,
L-赖氨酸4-9mM,
L-蛋氨酸0.1-0.7mM,
L-苏氨酸1-9mM,
L-色氨酸0.2-1.4mM,
L-结氨酸，2-5mM
L-脯氨酸7-10mM,
棉籽水解物300-3000mg/L,
大米水解物300-3000mg/L,
麦麸水解物300-3000mg/L,
重组胰岛素2-25mg/L,
丙酮酸钠50-300mg/L,
亚硒酸钠0.0010.04mg/L,
柠檬酸铁0.05-1mg/L,
亚油酸0.1-0.3mg/L,
大豆卵磷脂10-65mg/L,...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵峻岭，苏广华，黄新朋，
申请(专利权)人：内蒙古金源康生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15