一种体外骨髓间充质干细胞培养基制造技术

本发明专利技术属于体外细胞培养技术领域，具体涉及一种体外骨髓间充质干细胞培养基。本发明专利技术培养基包括以下组分及其浓度：基础培养基0.5‑1g/mL，白蛋白2‑4g/mL，胰岛素3‑6g/mL，环庚三烯酚酮1.37‑2.67μM，柠檬酸铁铵1.83‑2.18μM，川续断皂苷Ⅵ4‑8μM，亚硒酸钠20‑60ng/mL，氢化可的松10‑50μg/mL，还原型谷胱甘肽4.5‑8μg/mL，成纤维细胞生长因子35‑75ng/mL和鸟氨酸浓度为0.01‑0.10mM。本发明专利技术体外骨髓间充质干细胞无血清培养基具有贴壁效果良好，细胞增殖迅速，细胞延滞期短，扩增倍数高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种体外骨髓间充质干细胞培养基
本专利技术属于体外细胞培养
，涉及一种体外骨髓间充质干细胞培养基。
技术介绍
骨髓间充质干细胞(Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BM-MSCs)是存在于骨髓基质系统中非造血性的成体干细胞，能在体内和体外诱导分化成骨、软骨、脂肪、肌肉等组织，且具有免疫调节功能，因而可以作为组织工程理想的种子细胞来源。但骨髓中间充质干细胞含量极少，必须在体外进行扩增以获得足够的细胞数量来满足应用需求。目前，在BM-MSCs的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，比较常用是胎牛血清。血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用。但它也含有一些不利于细胞生长的抑制因子或毒性物质，具有潜在的细胞性作用。动物血清可能存在动物携带的已知未知病原体，对以后可能的临床应用构成威胁，对用于规模化培养细胞增加了难度。且每个批次的血清之间存在批间差异，使得到的培养结果出现差异。尽管研究人员尝试了很多的无血清培养基的方案，但无血清培养基普遍存在生长缓慢、甚至负增值的问题，致使处于RS的细胞进展到SR状态而丢失分化的能力。因此，无血清培养基用于间充质干细胞培养的研究至今也未取得重大突破。华南理工大学吴伟等人在论文“骨髓间充质干细胞无血清培养”中建立了一种化学成分明确的、能用于体外扩增骨髓间充质干细胞的无血清培养基α-MEM培养基添加10mg/LbFGF、10mg/LEGF、5g/LBSA、1.5mg/L还原型谷胱甘肽、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、1％(V/V)SITE、10mg/L氢化可的松、10nmol/L地塞米松和氨基酸浓缩液。该培养基中骨髓间充质干细胞集落形成率仅为有血清组的一半，表明该无血清培养基中可能还缺乏促进集落形成的细胞因子，培养基组分和各组分的有效浓度还需进一步优化，以促进干细胞的自我更新(生物工程学报，2009，25(1)：121-128.)。专利申请(CN101735980A)公布了一种体外培养骨髓间充质干细胞的完全培养基，其基础培养基为DMEM-L或DMEM/F12；所述培养基中还添加有胰岛素、白蛋白、转铁蛋白、业硒酸钠、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子、孕酮、还原型谷胱甘肽以及胎牛血清。该培养基采用低浓度的胎牛血清及其他添加成分进行复配，各成分起到协同作用，成功培养了骨髓间充质干细胞，从促进细胞增殖方面达到了与高浓度血清相同效果，在维持间充质干细胞干性方面优于胎牛血清。由此可知，随着骨髓干细胞研究进一步深入，干细胞的应用研究也有了逐步发展，进而如何安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的问题也越来越突出，亟需开发一种骨髓间充质干细胞合适的培养基。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，其能够促进骨髓间充质干细胞快速增殖。本专利技术通过以下技术方案实现：一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，主要包括以下组分：基础培养基0.5-1g/mL，白蛋白2-4g/mL，胰岛素3-6g/mL，环庚三烯酚酮1.37-2.67μM，柠檬酸铁铵1.83-2.18μM，川续断皂苷Ⅵ4-8μM，亚硒酸钠20-60ng/mL，氢化可的松10-50μg/mL，还原型谷胱甘肽4.5-8μg/mL，成纤维细胞生长因子35-75ng/mL，和鸟氨酸浓度为0.01-0.10mM。优选地，所述培养基由以下成分及浓度组成：基础培养基4.5g/mL，白蛋白2.75g/mL，胰岛素4.3g/mL，环庚三烯酚酮1.48μM，柠檬酸铁铵1.95μM，川续断皂苷Ⅵ5.7μM，亚硒酸钠35ng/mL，氢化可的松39μg/mL，还原型谷胱甘肽5.35μg/mL，成纤维细胞生长因子43ng/mL和鸟氨酸0.07mM。进一步，所述基础培养基为DMEM-L培养基或DMEM/F12培养基。本专利技术体外骨髓间充质干细胞无血清培养基各培养基成分是经过科学筛选得到的。白蛋白主要通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合而稳定和调节上述物质在无血清培养基中的活性作用，此外还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞的影响作用。胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是重要的细胞存活因子。环庚三烯酚酮和柠檬酸铁铵两者联合可与细胞表面受体结合传递铁离子，代替传统培养基中转铁蛋白的作用。在细胞培养基中，环庚三烯酚酮和柠檬酸铁铵两者联合能够影响铁的运输，进而影响细胞的生长，因此，确定环庚三烯酚酮和柠檬酸铁铵两者联合的最佳浓度尤为关键。川续断皂苷Ⅵ有促进骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化的能力。微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶的作用过程，消除氧化物酶和氧自由基对细胞的损害，因此亚硒酸钠的加入对细胞生长具有保护作用。成纤维细胞生长因子是维持骨髓间充质干细胞体外培养生存、增殖和分化所必须的补充因子。鸟氨酸在代谢中起到重要的作用。本专利技术体外骨髓间充质干细胞无血清培养基与现有体外骨髓间充质干细胞培养基相比，具有以下优点：(1)利用本专利技术培养基培养细胞，在细胞生长过程中，漂浮细胞少，具有良好的贴壁效果。(2)在本专利技术细胞培养基中，细胞增殖迅速，细胞延滞期短，扩增倍数高。附图说明图1骨髓间充质干细胞在A培养基(实施例1培养基)、B培养基(对比例1培养基)、C培养基(对比例2培养基)和培养基D(市售培养基，货号：BW110017)中生长曲线图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明，但这并非是对本专利技术的限制，本领域技术人员根据本专利技术的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本专利技术的基本思想，均在本专利技术的范围之内。原料来源：DMEM(L)干粉：美国Hyclone公司DMEM/F12干粉：Hyclone公司川续断皂苷Ⅵ：中国药品生物制品检定所下述骨髓间充质干细胞培养液配制所用到的基础培养基可以是DMEM(L)，也可以是DMEM/F12。实施例1一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，由以下组分及其浓度组成：基础培养基干粉4.5g/mL，白蛋白2.75g/mL，胰岛素4.3g/mL，环庚三烯酚酮1.48μM，柠檬酸铁铵1.95μM，川续断皂苷Ⅵ5.7μM，亚硒酸钠35ng/mL，氢化可的松39μg/mL，还原型谷胱甘肽5.35μg/mL，成纤维细胞生长因子43ng/mL和鸟氨酸0.07mM。体外骨髓间充质干细胞无血清培养基制备方法为：(1)准确称取相应浓度的基础培养基干粉，白蛋白，胰岛素，环庚三烯酚酮，柠檬酸铁铵，川续断皂苷Ⅵ，亚硒酸钠，氢化可的松，还原型谷胱甘肽，成纤维细胞生长因子，鸟氨酸，溶于体积为1L、温度为20-30℃超纯水中，搅拌至溶解完全，得溶液I；(2)用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调溶液II的pH至7.2，得溶液II。(3)将溶液II用0.22μm滤膜正压过滤除菌，即得。实施例2一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，由以下组分及其浓度组成：基础培养基干粉0.5g/mL，白蛋白2g/mL，胰岛素3g/mL，环庚三烯酚酮1.37μM，柠檬酸铁铵1.8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：主要包括以下组分：基础培养基0.5‑1g/mL，白蛋白2‑4g/mL，胰岛素3‑6g/mL，环庚三烯酚酮1.37‑2.67μM，柠檬酸铁铵1.83‑2.18μM，川续断皂苷Ⅵ4‑8μM，亚硒酸钠20‑60ng/mL，氢化可的松10‑50μg/mL，还原型谷胱甘肽4.5‑8μg/mL，成纤维细胞生长因子35‑75ng/mL和鸟氨酸浓度为0.01‑0.10mM。

【技术特征摘要】
1.一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：主要包括以下组分：基础培养基0.5-1g/mL，白蛋白2-4g/mL，胰岛素3-6g/mL，环庚三烯酚酮1.37-2.67μM，柠檬酸铁铵1.83-2.18μM，川续断皂苷Ⅵ4-8μM，亚硒酸钠20-60ng/mL，氢化可的松10-50μg/mL，还原型谷胱甘肽4.5-8μg/mL，成纤维细胞生长因子35-75ng/mL和鸟氨酸浓度为0.01-0.10mM。2.根据权利要求1所述体外骨髓间...

【专利技术属性】
技术研发人员：严志海，
申请(专利权)人：严志海，
类型：发明
国别省市：广东,44