间充质干细胞用培养基制造技术

本发明专利技术以提供不使用特别的装置、机材等而使以往困难的间充质干细胞的长期间的增殖培养成为可能的手段作为课题。通过提供甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸及谷氨酸的7种非必须氨基酸降低的间充质干细胞用培养基而解决了上述课题。

Medium for mesenchymal stem cells

The present invention provides a means to enable proliferation of difficult mesenchymal stem cells in the long term without the use of special devices, machines, and the like. By providing the 7 nonessential amino acids of glycine, alanine, serine, proline, asparagine, aspartic acid and glutamic acid, the reduced mesenchymal stem cells were solved with a culture medium.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】间充质干细胞用培养基
本专利技术涉及间充质干细胞用培养基及间充质干细胞的培养方法等。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcell；MSC)是在成体的骨髓等中存在的成体干细胞之一种，被定义为有向骨、软骨、脂肪细胞的分化能的粘接性的细胞。与胚性干(embryonicstem；(ES)细胞或人工多能性干(inducedpluripotentstem；iPS)细胞等的胚性的干细胞不同，被认为癌化的危险性极少，被视为作为再生医疗中使用的细胞材料大有希望。在日本，也以关节疾病为中心，已经进行多个临床研究。间充质干细胞，一般而言，被知为“老化”的细胞，被知为如果培养期间变长(分裂次数多)，则增殖速度的降低、进一步导致停止(非专利文献1)。在非专利文献1中报告，由在低氧分压下的培养可抑制人间充质干细胞(hMSC)的老化，但还不知培养基的氨基酸组成如何影响人间充质干细胞的老化或增殖。在专利文献1及专利文献2中，公开了由自培养基除去特定的氨基酸的干细胞培养技术的例。这些是与被称为ES细胞或iPS细胞的多能性干细胞相关的技术，是选择性地杀灭－除去分化诱导时残留的未分化状态的细胞，升高在细胞组合物中分化的物质的纯度的技术。至今日，无论是成体干细胞、多能性干细胞，在什么样的干细胞中都不知，来自培养基中的特定的氨基酸除去抑制细胞的老化，或促进增殖的例。【现有技术文献】【专利文献】专利文献1：特开2009-100702号公报专利文献2：WO2012/056997A1【非专利文献】非专利文献1：Jin，Y.，etal.，BiochemBiophysResCommun.，Vol.391，p.1471-1476。
技术实现思路
【专利技术要解决的技术课题】间充质干细胞是老化的细胞，被知为如果培养期间变长(分裂次数多)，则增殖速度的降低、进一步会导致停止。从而，不容易确保充分的细胞数，这成为进行人间充质干细胞的基础研究、临床应用方面的一个障碍。从而本专利技术旨在提供不使用特别的装置、机材等而比以往长期间增殖间充质干细胞、特别是人间充质干细胞的手段。【解决课题的技术方案】本专利技术人为解决上述课题而锐意探讨的结果发现，在甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸及谷氨酸的7种非必须氨基酸的量降低的培养液中培养人间充质干细胞，则相比在该非必须氨基酸的量未降低的通常的培养液中培养时更长期间的增殖培养变得可能，得到更多间充质干细胞。基于以上的见解完成本专利技术。即，本专利技术如下。[1]间充质干细胞用培养基，其中至少1种氨基酸的浓度是甘氨酸不足5μM、丙氨酸不足5μM、丝氨酸不足3μM、脯氨酸不足5μM、天冬酰胺不足1μM、天冬氨酸不足2μM、和/或谷氨酸不足3μM。[2]上述[1]所述的培养基，其中甘氨酸不足5μM。[3]上述[1]所述的培养基，其中甘氨酸不足1μM。[4]上述[1]～[3]之任一项所述的培养基，其中丙氨酸不足5μM。[5]上述[1]～[3]之任一项所述的培养基，其中丙氨酸不足1μM。[6]上述[1]～[5]之任一项所述的培养基，其中丝氨酸不足3μM。[7]上述[1]～[5]之任一项所述的培养基，其中丝氨酸不足0.7μM。[8]上述[1]～[7]之任一项所述的培养基，其中脯氨酸不足5μM。[9]上述[1]～[7]之任一项所述的培养基，其中脯氨酸不足1μM。[10]上述[1]～[9]之任一项所述的培养基，其中天冬酰胺不足1μM。[11]上述[1]～[9]之任一项所述的培养基，其中天冬酰胺不足0.1μM。[12]上述[1]～[11]之任一项所述的培养基，其中天冬氨酸不足2μM。[13]上述[1]～[11]之任一项所述的培养基，其中天冬氨酸不足0.5μM。[14]上述[1]～[13]之任一项所述的培养基，其中谷氨酸不足3μM。[15]上述[1]～[13]之任一项所述的培养基，其中谷氨酸不足0.7μM。[16]上述[1]所述的培养基，其中甘氨酸不足5μM、丙氨酸不足5μM、丝氨酸不足3μM、脯氨酸不足5μM、天冬酰胺不足1μM、天冬氨酸不足2μM、及谷氨酸不足3μM。[17]上述[1]所述的培养基，其中甘氨酸不足1μM、丙氨酸不足1μM、丝氨酸不足0.7μM、脯氨酸不足1μM、天冬酰胺不足0.1μM、天冬氨酸不足0.5μM、及谷氨酸不足0.7μM。[18]上述[1]～[17]之任一项所述的培养基，其含有实施了低分子除去处理的血清或血清替代物。[19]上述[18]所述的培养基，其中上述低分子除去处理由透析进行。[20]上述[18]或[19]所述的培养基，其中血清是人血清。[21]上述[1]～[20]之任一项所述的培养基，其不含非人动物来源的成分。[22]上述[1]～[21]之任一项所述的培养基，其中间充质干细胞是人间充质干细胞。[23]上述[22]所述的培养基，其中间充质干细胞是自骨髓采集的。[24]间充质干细胞的培养方法，其包括在上述[1]～[23]之任一项所述的培养基中培养间充质干细胞的工序。[25]上述[24]所述的培养方法，其中培养间充质干细胞的工序是使间充质干细胞增殖70天以上的工序。[26]细胞组合物，其由上述[24]或[25]所述的培养方法得到。[27]上述[26]所述的细胞组合物，其对选自CD73、CD90及CD105的至少1种标志物是阳性的。[28]上述[26]所述的细胞组合物，其对选自CD73、CD90及CD105的至少1种标志物是阳性的，并且对CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79、CD19及HLA-DR是阴性的。[29]细胞医疗用的细胞，其由上述[24]或[25]所述的培养方法得到。[30]间充质干细胞用培养基，其未添加甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸及谷氨酸而含有实施了低分子除去处理的血清或血清替代物。[31]上述[30]所述的培养基，其中添加组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、及缬氨酸。[32]上述[31]所述的培养基，其中还添加精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、及酪氨酸。【专利技术效果】由本专利技术使至今困难的间充质干细胞的长期间增殖培养变得可能。从而，可简便地得到更多间充质干细胞，使得为了在研究或医疗等中使用而大量地供给间充质干细胞变得可能。【附图说明】【图1】图1是显示由本专利技术的培养基培养人间充质干细胞(批编号：OF3825)7天中的细胞增殖促进效果的图。【图2】图2是显示由本专利技术的培养基培养人间充质干细胞(批编号：OF3825)约70天中的细胞增殖促进效果的图。【图3】图3是显示由本专利技术的培养基培养人间充质干细胞(批编号：OF3853及OF4266)约30天中的细胞增殖促进效果的图。【图4】图4是显示由本专利技术的培养基自人间充质干细胞(批编号：BM103)的第一继代起培养109天中的细胞增殖促进效果的图。横轴的括号内的数字表示自培养开始的天数。【图5】图5是显示由本专利技术的培养基培养的人间充质干细胞(批编号：BM103PN2(图5A)及BM105PN2(图5B))向脂肪细胞的分化促进效果的图。【实施方式】本专利技术提供选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸及谷氨酸的至少1种氨基酸的量降低的间充质干细胞用培养基(以下，有时本文档来自技高网...

【技术保护点】
间充质干细胞用培养基，其中至少1种氨基酸的浓度是：甘氨酸不足5μM、丙氨酸不足5μM、丝氨酸不足3μM、脯氨酸不足5μM、天冬酰胺不足1μM、天冬氨酸不足2μM、和/或谷氨酸不足3μM。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.21 JP 2014-1685801.间充质干细胞用培养基，其中至少1种氨基酸的浓度是：甘氨酸不足5μM、丙氨酸不足5μM、丝氨酸不足3μM、脯氨酸不足5μM、天冬酰胺不足1μM、天冬氨酸不足2μM、和/或谷氨酸不足3μM。2.权利要求1所述的培养基，其中甘氨酸不足5μM。3.权利要求1所述的培养基，其中甘氨酸不足1μM。4.权利要求1所述的培养基，其中丙氨酸不足5μM。5.权利要求1所述的培养基，其中丙氨酸不足1μM。6.权利要求1所述的培养基，其中丝氨酸不足3μM。7.权利要求1所述的培养基，其中丝氨酸不足0.7μM。8.权利要求1所述的培养基，其中脯氨酸不足5μM。9.权利要求1所述的培养基，其中脯氨酸不足1μM。10.权利要求1所述的培养基，其中天冬酰胺不足1μM。11.权利要求1所述的培养基，其中天冬酰胺不足0.1μM。12.权利要求1所述的培养基，其中天冬氨酸不足2μM。13.权利要求1所述的培养基，其中天冬氨酸不足0.5μM。14.权利要求1所述的培养基，其中谷氨酸不足3μM。15.权利要求1所述的培养基，其中谷氨酸不足0.7μM。16.权利要求1所述的培养基，其中甘氨酸不足5μM、丙氨酸不足5μM、丝氨酸不足3μM、脯氨酸不足5μM、天冬酰胺不足1μM、天冬氨酸不足2μM、及谷氨酸不足3μM。17.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：金永辉，原田育惠，千田将，小泽弘树，小林干，户口田淳也，池谷真，
申请(专利权)人：味之素株式会社，国立大学法人京都大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP