一种人源脂肪间充质干细胞因子及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种人源脂肪间充质干细胞因子及其制备方法和用途，具体地，本发明专利技术公开人源脂肪间充质干细胞因子的培养方法，它包括如下步骤：取人脂肪间充质干细胞，置于高辅酶无血清培养基中，培养至细胞汇合度75～85％时，收集上清液，即可。本发明专利技术还公开了人源脂肪间充质干细胞因子浓缩液的制备方法以及该方法制备得到的浓缩液及其进一步应用。本发明专利技术还公开了该方法制备得到细胞因子浓缩物以及用其制备的化妆品和药物。本发明专利技术方法制备得到的浓缩液脂肪间充质干细胞因子含量高，质量稳定，与其他材料在特定配比下组合物制备的产品，修复皮肤损伤的效果好；而且本发明专利技术方法简单易行、适合大规模生产，具有良好的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
一种人源脂肪间充质干细胞因子及其制备方法和用途
本专利技术属于皮肤修复
，具体涉及一种人源脂肪间充质干细胞因子及其制备方法和用途。
技术介绍
近年来，间充质干细胞分泌的因子已成为研究热点，这些细胞因子可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。将细胞因子添加到美容化妆品，不仅具有一般化妆品的保湿美白功效，还能够修复受损皮肤，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善面色等，越来越受到人们的关注。然而市面上的细胞因子化妆品一般采用直接掺入或经冻干后掺入化妆品基质的方式制造，细胞因子含量较低，且含有大量糖分等其它杂质，使用这些化妆品后反而会造成皮肤干燥脱皮等不适感。公开号为CN105543313A的申请公开了一种分离人源间充质干细胞因子的方法以及一种细胞因子化妆品或药物，每100ml化妆品或药物中包含权利要求6所述的间充质干细胞因子冻干粉0.5～1.5g，生物多糖胶0.1～1g，胶原蛋白1～5ml。但是其效果有待进一步改进。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种人源脂肪间充质干细胞因子及其制备方法和用途。本专利技术人源脂肪间充质干细胞因子的制备方法，它包括如下步骤：取人脂肪间充质干细胞，置于高辅酶无血清培养基中，培养至细胞汇合度75～85％时，收集上清液，即可；其中，所述高辅酶无血清培养基是每1L添加有辅酶A10mg～28mg、辅羧酶5mg～15mg、黄素腺嘌呤二核苷酸4mg～12mg、尿苷酸磷酸0.5mg～2.5mg的间充质干细胞无血清培养基。优选地，所述培养是在低氧条件下培养，其中，24h内细胞的氧浓度为21％，24h～26h氧浓度由21％均匀降到18％，第27h的氧浓度为18％，第28～36h氧浓度由18％均匀降到8％，第37h的氧浓度为8％，第38h～44h氧浓度由8％均匀降到2％，后持续于2％的氧浓度下培养；优选地，所述的细胞活率为97.3％。本专利技术还提供了一种人源脂肪间充质干细胞因子浓缩液的制备方法，步骤如下：a、按照前述的方法培养，得培养液上清；b、过滤、浓缩。其中，所述过滤、浓缩方法是：先采用0.22μm滤膜过滤；然后通过40KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过100D超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液,即可。本专利技术还提供了前述方法制备得到的人源脂肪间充质干细胞因子浓缩液。本专利技术还提供了一种人源间充质干细胞因子冻干粉的制备步骤，如下：取前述细胞因子浓缩液，冻干，得人源间充质干细胞因子冻干粉。其中，冻干前，先加入冻干保护剂；其中，所述冻干保护剂每100ml中含有如下组分：生育酚0.5g、谷胱甘肽0.4g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘露醇4g、羟脯氨酸0.05g、精氨酸0.2g、组氨酸0.2g、蛋氨酸0.2g、酪氨酸0.2g、氨基乙酸2g、柠檬酸钠0.26g。本专利技术还提供了前述方法制备得到的人源间充质干细胞因子冻干粉。本专利技术还提供了前述细胞因子浓缩液或前述细胞因子冻干粉在制备化妆品或者修复皮肤损伤的药物中的用途。本专利技术还提供了一种细胞因子化妆品或药物，每10ml化妆品或药物中包含前述间充质干细胞因子冻干粉0.005～0.05g，生物多糖胶0.1～0.145g，胶原蛋白溶液0.3ml，叶酸0.05g；优选地，每10ml中化妆品或药物中包含前述的间充质干细胞因子冻干粉0.05g，生物多糖胶0.1g，胶原蛋白溶液0.3ml，叶酸0.05g。本专利技术分离纯化人源脂肪间充质干细胞因子的方法，通过特定的低氧培养体系和培养基培养得到高浓度细胞因子培养液，并且可有效去除间充质干细胞培养液中的杂质，而且得到的细胞因子纯度高，产量高，并且脂肪组织取材容易，不再依托脐带组织来源，成本低廉。本专利技术的间充质干细胞因子浓缩液能够促进表皮细胞营养代谢；促进皮下胶原细胞功能，加速皮肤胶原细胞生长，增加胶原分泌，具有预防和修复皮肤损伤，延缓衰老，抗皱及美白等功效，而且使用时无皮肤干燥等不适感。本专利技术的间充质干细胞因子浓缩液与其他原料制备而成的化妆品或药品，可以增强其皮肤修复、抗老化、祛皱美白等美容护肤功效，具有良好的市场前景。下面通过具体实施方式对本专利技术做进一步详细说明，但是并不是对本专利技术的限制，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。附图说明图1为P5代ADSCADSC细胞表面标志图。图2为烫伤后48h创面。图3为烫伤后14d创面。图4左图为烫伤后18d创面。图5左图为烫伤后21d创面。图2-图5用药说明：a为含本专利技术细胞因子的凝胶；b为生理盐水；c为1％SD-Ag霜；d为成纤维细胞生长因子。具体实施方式下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照试剂盒说明书选择。实验试剂及仪器：试剂购买厂家CD45-FITCCD90-FITC美国Coulter公司HLA-DR-FITC美国Coulter公司CD105-PE美国Coulter公司DMEM/F12培养基美国GIBICO公司胰蛋白酶美国Sigma公司胎牛血清澳大利亚PAA无血清培养基美国GIBICO公司CoA(辅酶A)Solarbio公司TPP(辅羧酶)Solarbio公司FDA(黄素腺嘌呤二核苷酸)Solarbio公司UTP(尿苷酸磷酸)。Solarbio公司生物多糖胶Solabia公司胶原蛋白溶液(胶原蛋白浓度为10％)山东隆贝生物科技有限公司白蛋白成都蓉生药业有限责任公司无血清培养基美国GIBICO公司；EGFELISA试剂盒美国RD公司FGF美国RD公司VEGF美国RD公司实施例1本专利技术脂肪间充质干细胞因子的制备一、脂肪来源供者签署脂肪捐赠知情者同意书，采集前检查供者凝血功能、丙型肝炎病毒抗体、艾滋病病毒Ⅰ/Ⅰ抗体、乙型肝炎病毒抗原和梅毒螺旋体抗体。分离脂肪，保证所采脂肪无病毒污染。二、制备方法脂肪改良培养基和本专利技术低氧培养组：1、人脂肪间充质干细胞(AADSC)低氧培养上清液的获取(1)细胞培养：将采集瓶中下层液体用吸管吸出，留下黄色脂肪组织，注意不要吸到黄色脂肪颗粒；加入30ml生理盐水，振荡采集瓶，清洗脂肪组织，然后静置3分钟，待分层后用吸管吸出下层液体。反复重复此步骤，清洗3次；将采集瓶中清洗后的脂肪组织取出，每3ml放入一个100mm2培养皿中，用手术剪将脂肪组织剪成1mm3大小碎块，均匀铺在培养皿底部；每个培养皿加入10ml人脂肪干细胞无血清培养基，然后将培养皿放置在37℃，5％CO2培养箱中培养；培养过程中，每3天用倒置显微镜观察细胞生长情况，并将培养上清液吸出，添加10ml新鲜培养基。用倒置显微镜观察细胞生长情况，当观察到培养皿中细胞生长出来且汇合度达40％时，将培养皿中上清液和脂肪组织吸出，注意不要吸到细胞。加入1ml0.25％胰酶-0.38g/LEDTA溶液消化细胞。在显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，即可加入5ml培养基终止消化。用移液器轻轻吹打瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打，将细胞吹散。将细胞转移到15ml离心管中，1000rpm离心5min。弃上清，加入10ml培养基重悬细胞。此时获得的细胞为P0代脂肪干细胞。(2)制备种子库细胞将收本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源脂肪间充质干细胞因子的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：取人脂肪间充质干细胞，置于高辅酶无血清培养基中，培养至细胞汇合度75～85％时，收集上清液，即可；其中，所述高辅酶无血清培养基是每1L添加有辅酶A 10mg～28mg、辅羧酶5mg～15mg、黄素腺嘌呤二核苷酸4mg～12mg、尿苷酸磷酸0.5mg～2.5mg的间充质干细胞无血清培养基。

【技术特征摘要】
1.一种人源脂肪间充质干细胞因子的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：取人脂肪间充质干细胞，置于高辅酶无血清培养基中，培养至细胞汇合度75～85％时，收集上清液，即可；其中，所述高辅酶无血清培养基是每1L添加有辅酶A10mg～28mg、辅羧酶5mg～15mg、黄素腺嘌呤二核苷酸4mg～12mg、尿苷酸磷酸0.5mg～2.5mg的间充质干细胞无血清培养基。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述培养是在低氧条件下培养，其中，24h内细胞的氧浓度为21％，24h～26h氧浓度由21％均匀降到18％，第27h的氧浓度为18％，第28～36h氧浓度由18％均匀降到8％，第37h的氧浓度为8％，第38h～44h氧浓度由8％均匀降到2％，后持续于2％的氧浓度下培养；优选地，所述的细胞活率为97.3％。3.一种人源脂肪间充质干细胞因子浓缩液的制备方法，其特征在于：步骤如下：a、按照权利要求1或2所述的方法培养，得培养液上清；b、过滤、浓缩。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述过滤、浓缩的方法是：先采用0.22μm滤膜过滤；然后通过40KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过100D超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液,即可。5.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵明建，钟伟兴，
申请(专利权)人：广东康仹生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44