一种脂肪组织来源外泌体胶及制备方法及应用技术

本发明专利技术属于组织工程技术领域，尤其涉及脂肪组织来源外泌体胶及制备方法及应用，其特征在于：包括脂肪组织外泌体和溶剂，脂肪组织外泌体和溶剂质量体积比为1‑3：1，所述溶剂为水凝胶。制备方法包括脂肪组织的处理、脂肪组织提取液的获取、脂肪组织来源外泌体的获取和脂肪组织来源外泌体胶的制备等步骤，主要在促进脂肪再生中的应用。本发明专利技术具体涉及了从脂肪组织提取的外泌体，将其应用于裸鼠体内，可以新生出成熟的脂肪组织。这一发明专利技术克服了传统组织工程中种子细胞的来源不足，潜在恶性转变及成瘤的缺点，且这种外泌体具有容易保存和运输的优点。发明专利技术为组织工程脂肪的获取提供了一条新的思路。

Adipose tissue derived extracellular body glue, preparation method and application thereof

The invention belongs to the technical field of tissue engineering, in particular to adipose tissue derived exosomes adhesive and preparation method and application, which is characterized by comprising the adipose tissue of exosomes and solvent, fatty tissue exosomes and solvent quality volume ratio of 1 3:1, the solvent for hydrogel. The preparation method comprises adipose tissue processing, adipose tissue extract acquisition, acquisition and adipose tissue derived exosomes glue adipose tissue derived exosomes preparation steps, mainly in promoting the application of fat regeneration. The invention relates to an extra body extracted from adipose tissue, which can be used in nude mice to produce mature adipose tissue. The invention overcomes the disadvantages of insufficient source, potential malignant transformation and tumor formation of seed cells in traditional tissue engineering, and has the advantages of easy preservation and transportation. The invention provides a new idea for obtaining adipose tissue engineering.

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪组织来源外泌体胶及制备方法及应用
本专利技术属于组织工程
，尤其涉及脂肪组织来源外泌体胶及制备方法及应用，具体是用脂肪组织来源的外泌体在体内促进脂肪再生中的应用。
技术介绍
软组织缺损在创伤、肿瘤切除术后、先天畸形等情况下多有发生，整形美容领域，需要大量的软组织修复和重建患者的容貌与功能。组织工程技术的出现为整形美容修复开启了新的里程。传统组织工程认为组织再生需要三个关键要素，即种子细胞、支架材料与再生所需要的微环境。而由于脂肪组织来源广泛，获取方便且不受到医学伦理的限制，从脂肪组织中提取的间充质干细胞由于其多项分化潜能，被广泛应用于组织工程领域。然而干细胞的应用仍然有不少限制，例如干细胞获取程序的繁琐、细胞的衰老以及潜在的恶性转变及致瘤的可能性。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。外泌体是由细胞分泌的一种双层膜状结构的小囊泡，直径约40-150nm，携带了母细胞重要的信号分子，例如蛋白质、mRNA、miRNA和脂质等，通过与靶细胞的结合而调控细胞功能，参与细胞间交流。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。研究发现，脂肪组织除储存能量外，还具有活跃的内分泌功能，通过分泌众多激素和脂肪因子，参与调控多种病理生理过程。脂肪组织外泌体可以保持着与其母细胞相似的生物学功能，脂肪干细胞来源的外泌体在促进脂向分化及血管形成方面具有积极的促进作用。目前脂肪组织外泌体的提取方法多样，比如超速离心，膜过滤，免疫磁珠等方法，在提取过程中，但都会存在着有其他来源的蛋白及脂质的污染的技术问题和难点。脂肪组织外泌体在应用过程中也存在着许多难题，比如首先是外泌体支架材料的筛选，理想的支架材料首先需要安全无害，并且能够粘附外泌体，在体内可以逐渐吸收而不影响宿主的体内微环境；其次，因为外泌体的提取过程中会有一系列的物理化学操作，能否保证其安全无害上具有一定的难度。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种脂肪组织来源的外泌体胶及制备方法，及其在体内促进脂肪组织再生中的应用，本专利技术中用化学试剂法提取组织来源外泌体，提取过程相对简单且组织来源外泌体的量相对大，将其与操作性强的胶混合，具有操作性强，储存方便等效果，在体内应用方面也证实了这一混合物的促进成脂的特性。解决以上技术问题的一种脂肪组织来源外泌体胶，其特征在于：包括脂肪组织外泌体和溶剂，脂肪组织外泌体和溶剂质量体积比为1-3：1，所述溶剂为水凝胶。所述脂肪组织外泌体和溶剂质量体积比为1：1所述溶剂为基质胶。细胞与基底膜间的相互作用是调控细胞行为的重要因素之一。基质胶富含生长因子，可认为是一种可溶性的基底膜基质。主要成分包括：层黏连蛋白、胶原IV等，同时含TGF-β成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子以及其它在EHS肿瘤中自然表达的生长因子等。本专利技术中一种脂肪组织来源外泌体胶的制备方法：包括以下步骤：(1)脂肪组织的处理：取已处死大鼠体，做腹股沟切口获取SD大鼠双侧腹股沟脂肪组织，冲洗后将脂肪组织剪碎成1-2mm3；剪碎后的组织相对面积增大且有利于悬浮培养的搅拌，利于外泌体的产生与收集。(2)脂肪组织提取液的获取：将由步骤(1)获取的剪碎的脂肪组织转移到Celstir悬浮培养瓶中，加入α-MEM培养基，保持悬浮培养基为100-110rpm的转速，存放于35-38℃，4-5％CO2的培养箱，连续三天后用细胞筛过滤并收集上清液，离心、过滤上清液，离心、过滤上清液后再用0.20-0.25微米的滤器过滤取过滤液放于3KD膜的离心过滤器中，温度3-5℃，4500-5200g转速离心28-32min，获得脂肪组织提取液；α-MEM培养基不含有血清，悬浮培养体系放在孵箱中，保持100rpm的转速连续转动3天，保持脂肪组织悬浮的状态，获取的外泌体的量比较多且稳定；细胞筛孔径为150目，目的在于过滤掉组织残渣而获取液体。优化方案中脂肪组织与培养基的体积比为1:3-4；优化方案中保持悬浮培养基为100rpm的转速，存放于35℃，5％CO2的培养箱，连续三天后用细胞筛过滤并收集上清液，离心、过滤上清液后再用0.20-0.25微米的滤器过滤；再取过滤液放于3KD膜的离心过滤器中，温度4℃，5000g转速离心30min。放于悬浮培养瓶中保持悬浮的状态培养相对于传统的贴壁法(即为静止状态)获取的外泌体的量比较多且稳定。上清液分别两次离心转速，第一次离心目的是为了去除细胞筛未过滤干净的组织块残留和细胞碎片，而第二次离心加上了膜过滤，为的是初步筛选含有分子量接近外泌体的因子的液体，同时进行浓缩。(3)脂肪组织来源外泌体的获取：将由步骤(2)获得的脂肪组织提取液中加入外泌体提取试剂，脂肪组织提取液和外泌体提取试剂用量比例为1.8-2.2：1，3-5℃过夜后以3-5℃、8000-12000g离心50-70min，取沉淀，即得脂肪组织来源外泌体；过夜和3-5℃为让提取溶剂与提取液充分混合溶剂。优化方案中脂肪组织提取液和外泌体提取试剂用量比例为2：1，4℃过夜后以4℃、10000g离心1h。(4)基质胶复合脂肪组织来源外泌体植入物的制备：将溶剂置于冰上，3-5℃冰箱过夜融化，同时预冷操作工具；取脂肪组织来源外泌体用融化后的液态溶剂重悬，外泌体最终浓度为0.8-1.2mg/ml，将获得的混有脂肪组织来源外泌体的液态溶剂转移入预冷的一次性医用注射器中，置于冰上保存。优化方案中外泌体最终浓度为1mg/ml。置于冰上预冷，温度保持在4摄氏度左右，保证溶剂为可注射液态时间在进行体内实验注入溶剂截止，一般在1h以内。混有脂肪组织来源外泌体的液态溶剂为粘性较大的液体状态，可被注射器吸取注射，呈流动状态，滴出不能成形，湿润角小于九十度。外泌体提取试剂可为TotalExosomeIsolationTMreagent(LifeTechnologies,USA)、ExoQuick-TC(SBI)或exoEasyMaxiKit(qiagen)等。本专利技术中的制备方法中直接组织来源，无需额外培养，有着悬浮培养的应用，从整体技术方案和效果上都有好的作用。所述步骤(2)中脂肪组织提取液的浓度为2-5mg/ml。所述步骤(2)中上清液以2100-2200g,离心22-28min，再取上清液用0.20-0.25微米的滤器过滤；优化方案中上清液以2180g,离心25min，再取上清液用0.22微米的滤器过滤。纯度上，要求在提取外泌体之前，没有细胞残留，没有细胞碎片，这样可以减少其他来源的蛋白及脂质污染。所述步骤(3)中进行先提纯浓缩后再加入外泌体提取试剂，提纯步骤为脂肪组织提取液用3KD分子量膜过滤后采用高速离心，即3-5℃以8000-12000g离心50-70min在优化方案中提纯步骤为脂肪组织提取液用3KD分子量膜过滤后采用高速离心，即4℃以10000g离心60min。本专利技术中一种脂肪组织来源外泌体胶的应用，在体内促进脂肪再生中的应用，也在各种损伤造成的软组织缺损模型上的应用。本专利技术的有益效果如下：本专利技术应用的是组织来源的外泌体，不但避免了应用干细胞带来的耗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪组织来源外泌体胶，其特征在于：包括脂肪组织外泌体和溶剂，脂肪组织外泌体和溶剂质量体积比为1‑3：1，所述溶剂为水凝胶。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪组织来源外泌体胶，其特征在于：包括脂肪组织外泌体和溶剂，脂肪组织外泌体和溶剂质量体积比为1-3：1，所述溶剂为水凝胶。2.根据权利要求1所述的一种脂肪组织来源外泌体胶，其特征在于：所述脂肪组织外泌体和溶剂质量体积比为1：1。3.根据权利要求1所述的一种脂肪组织来源外泌体胶，其特征在于：所述溶剂为基质胶。4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种脂肪组织来源外泌体胶的制备方法：包括以下步骤：(1)脂肪组织的处理：取已处死大鼠体，做腹股沟切口获取SD大鼠双侧腹股沟脂肪组织，冲洗后将脂肪组织剪碎成1-2mm3；(2)脂肪组织提取液的获取：将由步骤(1)获取的剪碎的脂肪组织转移到Celstir悬浮培养瓶中，加入α-MEM培养基，保持悬浮培养为100-110rpm的转速，存放于35-38℃，4-5％CO2的培养箱，连续三天后用细胞筛过滤并收集上清液，离心过滤上清液，取过滤液放于3KD膜的离心过滤器中，温度3-5℃，4500-5200g转速离心28-32min，获得脂肪组织提取液；优化方案中脂肪组织与培养基的体积比为1:3-4；优化方案中保持悬浮培养基为100rpm的转速，存放于35℃，5％CO2的培养箱，连续三天后用细胞筛过滤并收集上清液，离心、过滤上清液后再用0.20-0.25微米的滤器过滤，过滤液进一步放于3KD膜的离心过滤器中，温度4℃，5000g转速离心30min；(3)脂肪组织来源外泌体的获取：将由步骤(2)获得的脂肪组织提取液中加入外泌体提取试剂，脂肪组织提取液和外泌体提取试剂用量比例为1.8-2.2：1，3-5℃过夜后以3-5℃、8000-12000g离心50-70...

【专利技术属性】
技术研发人员：田卫东，于湄，戴敏佳，张岩，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51