本发明专利技术公开了一种尿液外泌体microRNA分子标志物的应用及制备的试剂盒。该尿液外泌体microRNA分子标志物为hsa-miR-1202和hsa-miR-1207-5p中任意一个或两个，该应用主要是指该分子标志物用于制备狼疮性肾炎活动性检测试剂盒，通过定量检测尿液外泌体microRNA分子标志物hsa-miR-1202和hsa-miR-1207-5p中的一种或两种来判断狼疮性肾炎的活动性。本发明专利技术试剂盒简单快速、经济实用且便于临床开展。
【技术实现步骤摘要】
： 本专利技术属于医学分子生物学
，具体涉及一种尿液外泌体microRNA分子标 志物在制备狼疮性肾炎活动性评估制剂方面的应用。
技术介绍
： 红斑狼疮(LE)是一种经典的自身免疫性疾病。此病不仅可以累及皮肤，也可累及 其他器官和系统。多器官、多系统受累的红斑狼疮称之为系统性红斑狼疮(SLE)。系统性红 斑狼疮是一种严重危害人类健康的慢性复杂性疾病。狼疮性肾炎(LN)是SLE最常见和最严 重的内脏损害，也是SLE预后不良的主要原因。在疾病初期，有尿检或者肾功能异常者占 25%~50%，而肾活检显示几乎所有SLE患者均有不同程度的肾损害。LN是我国最常见的继 发性肾小球疾病之一，常反复发作，约20%在10年内发展为尿毒症。红斑狼疮治疗的目的在 于控制病情，减缓疾病进展，保持病情长期缓解与稳定，防治重要器官损害。特别强调早期 诊断和早期治疗，以避免或延缓不可逆转的组织器官损害。 外泌体（exosome)是一些小的、分泌的、由膜包裹的亚细胞结构，直径通常小于 100nm，以30-50nm为主。自1987年在兔网织红细胞变成成熟的红细胞过程中发现外泌体的 分泌以来，相继又在其他一些哺乳动物如猪、鼠、兔等的体内发现。外泌体可以由B淋巴细 胞、树突状细胞、血小板、肿瘤细胞系、肥大细胞、肝细胞、上皮细胞、间充质干细胞等各种细 胞分泌，并具有体内抗原递呈、抑制肿瘤细胞生长、传递成形素、诱导淋巴细胞凋亡、胞间膜 交换、免疫治疗、免疫调控的作用。外泌体几乎存在于所有的体液中，如人的支气管肺泡灌 洗液、恶性胸腔积液、血浆、尿液、乳汁、羊水、腹水、唾液、脑脊液、胆汁、精液等。近些年，基 于外泌体寻找疾病的相关生物标志物引起了研究人员广泛的关注，特别是自2007年发现外 泌体包含丰富的小RNA，尤其是microRNA之后，以外泌体microRNA为基础筛查疾病的相关生 物标志物得到了长足的发展。microRNA是一些小的非编码RNA，长度通常为21个碱基，它们 以其靶向针对信使RNA 3'非翻译区来抑制翻译和即使有大量核酶存在也依然稳定存在于 各种体液中而被广泛用做生物标志物。本专利技术的目的即是首次发现了某些尿液外泌体 mi croRNA可以作为筛查狼疮性肾炎活动性相关的生物标志物。
技术实现思路
： 本专利技术的目的是提供一种尿液外泌体microRNA分子标志物在制备狼疮性肾炎活 动性检测试剂盒中的应用，以及制备的试剂盒。 尿液外泌体microRNA分子标志物在制备狼疮性肾炎活动性检测试剂盒中的应用， 所述的尿液外泌体microRNA分子标志物是hsa-miR-1202和hsa-miR-1207_5p中的一种或两 种； 所述 hsa-miR-1202 的序列是:GUGCCAGCUGCAGUGGGGGAG; 所述 hsa-miR-1207-5p 的序列是：UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG。 所述的狼疮性肾炎活动性检测试剂盒为用于定量检测尿液外泌体microRNA分子 标志物hsa-miR-1202和hsa-miR-1207-5p中的一种或两种的试剂盒。具体是为实时荧光定 量PCR检测试剂盒。 -种具有狼疮性肾炎活动性检测能力的试剂盒，包括尿液外泌体提取系统、外泌 体总RNA提取系统、反转录系统、扩增系统和相对定量内参标准化系统;所述的试剂盒是通 过定量检测尿液外泌体microRNA分子标志物hsa-miR-1202和hsa-miR-1207_5p中的一种或 两种来判断狼疮性肾炎的活动性;所述hsa-miR-1202的序列是:GUGCCAGCUGCAGUGGGGGAG; 所述hsa-miR-1207-5p的序列是:UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG。所述的相对定量内参标准化系 统由hsa-miR-16组成。 所述尿液外泌体提取系统包括40%PEG6000(聚乙二醇6000); 所述外泌体总RNA提取系统包括2 X Denaturing Solution(2 X变性液）、Acid-Phenol CHCl3(酸氯仿）、miRNA Wash Solution l(miRNA清洗液l)、Wash Solution 2/3(清 洗液2/3)、RNase_free ddH2〇(无酶水）； 所述反转录系统包括5XRT primer(5X反转录引物）和dNTP Mix(dNTP混合物）、 Reverse transcriptase(反转录酶）、10XRT Buffer(10X 反转录缓冲液）、RNase Inhibiter(RNA酶抑制剂）、RNase_free ddH2〇(无酶水）； 所述扩增系统包括2XMaster Mix(2X预混液）和20XTM probe(20XTM探针）、 RNase-free ddH2〇〇 本专利技术的优点是： 首先，本专利技术所提供的尿液外泌体microRNA分子标志物包括hsa-miR-1202和hsa-miR-1207-5p中任意一个或两个，这些分子标志物都能够单独或者结合起来用于检测狼疮 性肾炎活动性。具体是用于制备狼疮性肾炎活动性检测试剂盒，该试剂盒通过定量检测尿 液外泌体microRNA分子标志物hsaniR-1202和hsa-miR-1207_5p中的一种或两种来筛查和 判断狼疮性肾炎的活动性。其次，由于尿液具有取材方便，无创伤性，并可连续体外检测的 优点，因此从尿液中寻找生物标志物可以将狼疮性肾炎活动性的早期筛查和诊断提高至一 个新的水平；同时，通过实时荧光定量PCR技术对狼疮性肾炎尿液外泌体microRNA水平的检 测，定量准确，相对于芯片技术、分子杂交技术或者高通量测序技术，该方法简单快速、经济 实用且便于临床开展。 以下结合【附图说明】和【具体实施方式】进一步详细的解释和说明本专利技术，而不会限制 本专利技术的保护范围。【附图说明】： 图1是用透射电镜的方法鉴定所提取的尿液外泌体； 图2是用Agilent 2100生物分析仪分析尿液外泌体所提取总RNA大小； 图3是用Agilent microRNA芯片分析尿液外泌体所提取总RNA中microRNA种类，其 中RA1、RA2、RA3为活动性狼疮性肾炎，non-RAl、non-RA2、non-RA3为非活动性狼疮性肾炎， HC1、HC2、HC3为健康对照； 图4a是本专利技术所提供的hsa-miR-1202在活动性狼疮性肾炎、非活动性狼疮性肾 炎、健康对照尿液外泌体样本中经RT-qPCR相对定量分析图； 图4b是本专利技术所提供的hsa-miR-1207-5p在活动性狼疮性肾炎、非活动性狼疮性 肾炎、健康对照尿液外泌体样本中经RT-qPCR相对定量分析图；图4c是本专利技术所提供的相对定量内参标准化系统hsa-miR-16在活动性狼疮性肾 炎、非活动性狼疮性肾炎、健康对照尿液外泌体样本中经RT-qPCR采用原始Ct值的分析图； 图5a是本专利技术所提供的hsa-miR-1202在活动性狼疮性肾炎、非活动性狼疮性肾炎 尿液外泌体样本中R0C诊断分析图；曲线下的面积 检验结果变量:以miR16为内参的相对定量检验结果变量以miR16为内参的相对定量至少有一个在正实际状态组和负实际状 态组之间的结。统计数据可能有偏差。 a.按非参数假设 b.原假本文档来自技高网...
【技术保护点】
尿液外泌体microRNA分子标志物在制备狼疮性肾炎活动性检测试剂盒中的应用，所述的尿液外泌体microRNA分子标志物是hsa‑miR‑1202和hsa‑miR‑1207‑5p中的一种或两种；所述hsa‑miR‑1202的序列是：GUGCCAGCUGCAGUGGGGGAG；所述hsa‑miR‑1207‑5p的序列是：UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陆前进，刘莹，赵明，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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