本发明专利技术属于生物技术领域，提供了间充质干细胞来源的外泌体在制备防治丙型肝炎病毒(HCV)药物中的应用。本发明专利技术的外泌体主要通过以下方法制备：分离培养的人间充质干细胞；条件培养基的收集；外泌体的提取、浓缩和纯化。本发明专利技术通过体外建立的细胞来源的丙型肝炎病毒(HCVcc)模型、HCV易感靶细胞人肝癌细胞系Huh7，对人间充质干细胞来源的外泌体的抗HCV活性进行了检测。实验结果显示，人脐带、骨髓以及外周血来源间充质干细胞分泌的外泌体具有显著的抗HCV活性，能显著抑制病毒RNA在细胞中的水平，同时实验数据提示，外泌体处理后的细胞均明显上调具有抗病毒活性的4种microRNAs(Let-7f,miR-145,miR-199a and miR-221)。本发明专利技术为抗HCV治疗提供了新的来源和方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及生物
，具体地说，是间充质干细胞（mesenchymalstemcell, MSC)中的外泌体提取制备的方法及其在防治丙型肝炎病毒中的应用。
技术介绍
间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs)是具有治疗效果的一种前 体祖细胞（JungY,BauerG,NoltaJA.Concisereview:Inducedpluripotentstem cell-derivedmesenchymalstemcells:progresstowardsafeclinicalproducts. Stemcells. 2012;30:42-47)。报道显示，它能缓解炎症，调节免疫反应及促进组织再生 (ShiΜ,ZhangZ,Xu民，etal.Humanmesenchymalstemcelltransfusionissafeand improvesliverfunctioninacute-on-chronicliverfailurepatients.Stemcells translationalmedicine. 2012 :1:725-731)D目前，MSC作为治疗方法已经进入两个2/3期 和四个3期临床试验中。人腑带间充质干细胞是通过非侵入手段从人腑带组织中获得的， 具有可长期传代特性的MSC(QienW,LiuJ，Manuchehrabadi化etal.Umbilicalcordand bonemarrowmesenchymalstemcellseedingonmacroporouscalciumphosphatefor boneregenerationinratcranialdefects.Biomaterials. 2013 ;34:9917-9925)。人骨 髓、外周血分离的MSC也是通过医疗过程中，从剩余的医疗样本中所提取的细胞。 近期研究显示，MSC的许多功能都是通过旁分泌的外泌体发挥作用化ordelas L,民ebmannV，LudwigAK,etal.MSC-derivedexosomes:anoveltooltotreat therapy-refractorygraft-versus-hostdisease.Leukemia. 2014 ;28:970-973)。夕h泌 体是由脂质双分子膜构成的50-100nm的小囊泡，其中含有与其来源和功能密切相关的蛋 白质、脂质及核酸，其中核酸WmicroRNA为主。外泌体可通过与细胞膜融合的方式，将生 物学活性物质从供体细胞传递至受体细胞，发挥其生物学功能（Mesenchymalstemcell exosome:anovelstemcel1-basedtherapyforcardiovasculardisease.民egenerative medicine. 2011 :6:481-492)。因其外有细胞来源的脂质膜包裹，其内的生物学成分的 稳定性及活性得到较好的保护。近几年研究显示，外泌体既可携带感染性物质，也能传 递保护性分子化alamvokiΜ，DuΤ，RoizmanΒ.Cellsinfectedwithherpessimplex viruslexporttouninfectedcellsexosomescontainingSTING，viralmRNAs，and microRNAs.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStates ofAmerica. 2014:111:E4991_4996;MadisonMN,JonesPH,OkeomaCM.Exosomesin humansemenrestrictHlV-ltransmissionbyvaginalcellsandblockintravaginal replicationofLP-BM5murineAIDSviruscomplex.Virology. 2015 ;482:189-201)。但 关于间充质干细胞分泌外泌体的抗丙型肝炎病毒的作用，目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供W间充质干细胞分泌的外泌体的制备方法，及其在防治丙型 肝炎中的应用。 本专利将利用间充质干细胞来源的外泌体的特有的microRNA表达水平，提供其 在肝炎药物研发、保肝食品和保健品中的应用，为microRNA的祀向治疗提供新的思路。 本专利技术的第一方面，提供了W厮带、骨髓W及外周血间充质干细胞分泌的外泌体。 其中间充质干细胞，可选自新鲜厮带、骨髓W及外周血培养的人间充质干细胞，详 细步骤参照实施例1。也可W通过美国ScienCell公司购得。 本专利技术的第二方面，提供了上述间充质干细胞分泌的外泌体的制备方法。步骤如 下：A.厮带、骨髓W及外周血间充质干细胞的分离及传代培养； B.条件培养基的储备，所述的条件培养基，为将去除血清的干细胞培养基加入间 充质干细胞，48-96h的培养上清液；C.外泌体的提取、浓缩与纯化。 其中，步骤A较优的是：取新生儿的新鲜厮带，经DMEM反复冲洗后，浸泡于含有 1 %青霉素、链霉素的L-DMEM中；10分钟后，将组织取出并用组织剪剪成约1mm的组织块； 将组织块放入含有10%胎牛血清的L-DMEM培养基中，5% 0)2、37°C、95%湿度条件下进行 培养；约1周后可见厮带间充质干细胞爬出生长，将组织块去除，W0. 25%膜蛋白酶消化细 胞进行传代培养。或将获得的新鲜骨髓或者外周血样本通过Ficoll梯度离屯、去除单核细 胞，随后将细胞重悬于10%胎牛血清的α-最小必需培养基中，5%C02、37°C、95%湿度条 件下进行培养；两天后更换培养基将未贴壁的细胞去除，并传代培养。 步骤B较优的是：将去除外泌体的干细胞培养基（制备方法请参照实施例1)加入 培养的间充质干细胞中，收取48-9化培养上清液，即为条件培养基。可将培养上清液暂时 冻存于-80°C冰箱，待收集至一定体积后（> 150ml)用来提取外泌体； 步骤C较优的是：条件培养基于4°C300g，lOmin离屯、除去细胞碎片；条件培养基 依次在4°C、500g、lOmin及4°C、2000g、lOmin条件下离屯、去除死细胞及细胞碎片等杂质；随 后培养基通过0. 22μm滤膜过滤；将过滤后的液体在4°C、105Xg、ISOmin进行超速离屯、，得 到含有间充质干细胞分泌的外泌体沉淀，加入200μ1PBS洗涂；再次4°C、105Xg、120min 超速离屯、，即得浓缩、纯化的外泌体。 本专利技术的第Ξ方面提供了上述间充质干细胞来源的外泌体在制备防治丙型肝炎 病毒药物中的应用。 进一步地，本专利技术提供了间充质干细胞分泌的外泌体在制备保肝或预防丙型肝炎 病毒感染的食品或保健品中的应用。 将本专利技术所述的间充质干细胞分泌的外泌体用于体外抗丙型肝炎病毒（HCV)感 染，详细步骤参照实施例2。 本专利技术经实验证明，间充质干细胞分泌的外泌体具有显著的抗HCV感染，明显下 调HCVRNA水平，为临床治疗丙型肝炎开辟新的途径。 本专利技术的优点在于： 本专利技术为间充质干细胞分泌的外泌体提供了一种制备抗HCV药物的用途。通过体 本文档来自技高网...
【技术保护点】
间充质干细胞分泌的外泌体在制备防治丙型肝炎病毒药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钱汐晶，徐辰，赵平，戚中田，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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